王亞云，趙力，譚婷婷，徐麗，王家林(青島科技大學(xué)生物系，山東青島266042)

胰蛋白酶是消化酶的一種，它作為絲氨酸蛋白酶家族中的成員廣泛存在于生物有機(jī)體中［1］。絲氨酸蛋白酶家族包括多種形式的酶類，如胰腺蛋白消化酶﹑凝血系統(tǒng)中的肝臟蛋白酶等。其中胰蛋白酶屬于胰腺蛋白消化酶的一種。在胰臟中其最初分泌物為胰蛋白酶原，經(jīng)降解而成為具有活性的酶。另外，絲氨酸蛋白酶原為了避免在體內(nèi)細(xì)胞中自溶，在氨基末端區(qū)域會(huì)轉(zhuǎn)化為不含信號(hào)序列的酶原［2］。胰蛋白酶是肽鏈內(nèi)切酶，其作用部位是賴氨酸或精氨酸羧基端的肽鍵，所以由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈均能被胰蛋白酶選擇性地水解［3］。胰蛋白酶能消化溶解變性蛋白質(zhì)，促進(jìn)肉芽組織新生，常用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)前對(duì)組織的處理［4］，其作用機(jī)理是胰蛋白酶水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，從而使細(xì)胞離散。另外，絲氨酸家族的蛋白酶還能參與一些生理過程的反應(yīng)，如免疫防御反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)制和產(chǎn)卵行為反應(yīng)［5－10］。

目前，關(guān)于胰蛋白酶分子量的研究較多。如哺乳動(dòng)物中牛胰蛋白酶分子量為23.3 kD，豬胰蛋白酶分子量為24.0 kD，水產(chǎn)魚類中胰蛋白酶分子量在20～30 kD［11］。國外關(guān)于蝦類胰蛋白酶分子量的報(bào)道較多，如Osnes等從南極大磷蝦中提取到3種胰蛋白酶相對(duì)分子量為32～33 kD。Anheller等從南極大磷蝦的提取物中得到相對(duì)分子量在24～33 kD的3種絲氨酸胰蛋白。

胰蛋白酶含有催化三聯(lián)體氨基酸，具有決定結(jié)合底物特異性的一個(gè)關(guān)鍵氨基酸Tyr;位于催化活性部位絲氨酸附近的氨基酸(Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro)是絲氨酸蛋白酶的典型特征序列［12］。研究表明，鰲蝦胰蛋白酶氨基酸序列中含6個(gè)半胱氨酸殘基，而脊椎動(dòng)物中含12個(gè)。大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有一段保守序列，這是絲氨酸蛋白酶的特性。無脊椎動(dòng)物中胰蛋白酶N端開始的氨基酸序列均為IVGG，此序列是胰蛋白酶的保守序列［3］。

系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果能夠反映各種動(dòng)物的分類地位與進(jìn)化上的關(guān)系，筆者在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載胰蛋白酶的氨基酸序列，進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以分析胰蛋白酶基因的分子進(jìn)化特征。

1 材料與方法

1.1 材料 在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載動(dòng)物胰蛋白酶氨基酸序列，序列為Fasta格式。

1.2 方法 首先進(jìn)入 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/下載胰蛋白酶的氨基酸序列。將下載的胰蛋白酶氨基酸序列用CLUSTAL X2程序進(jìn)行比較，同時(shí)運(yùn)用MEGA3.1軟件包的Neighbor-joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，并用相關(guān)方法檢測樹的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對(duì)分析 對(duì)11個(gè)物種的胰蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，物種分別為Mus musculus(小家鼠)、Scylla paramamosain(青蟹)、Tribolodon hakonensis(珠星三塊魚)、Homo sapiens(人類)、Marsupenaeus japonicus(日本對(duì)蝦)、Litopenaeus vannamei(南美白對(duì)蝦)、Myxocyprinus asiaticus(胭脂魚)、Gadus chalcogrammus(狹鱈)、Culex quinquefasciatus(致乏庫蚊)、Portunus trituberculatus(三疣梭子蟹)、Rattus norvegicus(褐家鼠)。序列比對(duì)結(jié)果表明，絲氨酸家族胰蛋白酶具有保守的催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)，且含有6個(gè)保守的半胱氨酸形成3對(duì)肽內(nèi)二硫鍵。在第3個(gè)催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)附近有絲氨酸蛋白酶的典型特征序列:G-D-S-G-G-P(Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro)，在此特征序列之前的8個(gè)氨基酸也十分保守，除trypsinX3物種外，其他物種的氨基酸序列大都為Glu(谷氨酸)-Gly(甘氨酸)-Gly(甘氨酸)-Lys(賴氨酸)-Asp(天冬氨酸)-Ser(絲氨酸)-Cys(半胱氨酸)-Gln(谷氨酰胺)(其中S.paramamosain、C.quinquefasciatus和P.trituberculatus的丙氨酸以及C.quinquefasciatus的纈氨酸除外)。在N端附近，除trypsinX3物種外，其他物種胰蛋白酶都具有IVGG氨基酸序列。在C端附近，所有物種都有一段保守序列WI(G.chalcogrammus除外);除trypsinX3物種外，其他物種胰蛋白酶都具有VSWG、GCA以及PGVY氨基酸保守序列(C.quinquefasciatus除外)。胰蛋白酶氨基酸序列的底物結(jié)合位點(diǎn)為Asp(天冬氨酸)，該殘基通過電荷作用而穩(wěn)定底物裂解位點(diǎn)，因而也決定著胰蛋白酶的專一性(圖1)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 下載了28個(gè)物種的胰蛋白酶氨基酸序列，物種分別為Aedes aegypti(埃及斑蚊)、Anopheles gambiae(岡比亞按蚊)、Anopheles sinensis(中華按蚊)、Culex pipiens(尖音庫蚊)、C.quinquefasciatus(致乏庫蚊)、Danaus plexippus(黑脈金斑蝶)、Antheraea pernyi(柞蠶)、Antheraea yamamai(天蠶)、Choristoneura fumiferana(云杉芽卷蛾)、Manduca sexta(煙草天蛾)、L.vannamei(南美白對(duì)蝦)、M.japonicus(日本對(duì)蝦)、S.paramamosain(青蟹)、P.trituberculatus(三疣梭子蟹)、Portunus pelagicus(遠(yuǎn)海梭子蟹)、H.sapiens(人類)、R.norvegicus(褐家鼠)、M.musculus(小家鼠)、M.asiaticus(胭脂魚)、Lutjanus fulvus(黃足笛鯛)、T.hakonensis(珠星三塊魚)、Ctenopharyngodon idella(草魚)、G.chalcogrammus(狹鱈)、Boreogadus saida(北鱈)、Paranotothenia magellanica(毛利鱈魚)、Oncorhynchus masou(馬蘇麻哈魚)、Parahucho perryi(哲羅魚)、Salvelinus leucomaenis(紅點(diǎn)鮭)。

結(jié)合Neighbor-joining方法，使用Mega3.1軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。從圖2可以看出，不同物種來源的胰蛋白酶在進(jìn)化樹上分為2個(gè)大分支，分別屬于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。其中無脊椎動(dòng)物分支中又有2個(gè)小分支，分別為蚊蟲類、蝦蟹類。脊椎動(dòng)物也有2個(gè)分支，trypsinX3物種被單獨(dú)分為一支，其他脊椎動(dòng)物(人類、鼠類、魚類)聚為一支。

3 討論

對(duì)下載的胰蛋白酶基因的氨基酸序列進(jìn)行分析表明，脊椎動(dòng)物與無脊椎動(dòng)物的胰蛋白酶氨基酸序列有一定的同源性。這些序列中有胰蛋白酶所特有活性三聯(lián)體、底物結(jié)合部位的Gly殘基，及其他結(jié)構(gòu)上的保守區(qū)域，如VSWG、GCA以及PGVY序列。在絲氨酸蛋白酶中，催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)之間通過氫鍵相互作用，His通過吸收來自Ser的一個(gè)質(zhì)子，從而激活催化反應(yīng)［13］。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果能夠反映各種動(dòng)物的分類地位與進(jìn)化上的關(guān)系:首先是脊椎動(dòng)物與無脊椎動(dòng)物這2種動(dòng)物的最先分化，然后依次分化出人類、鼠類、魚類、蚊蟲類、蝦蟹類。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與現(xiàn)有的以表型特征為依據(jù)的分類結(jié)果一致，證明利用保守的胰蛋白酶基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析可以對(duì)現(xiàn)行的以外形結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為依據(jù)的分類系統(tǒng)加以驗(yàn)證，為判斷各物種的分類地位和親緣關(guān)系提供準(zhǔn)確可靠的分子標(biāo)記。綜上所述，該研究對(duì)多種動(dòng)物胰蛋白酶基因進(jìn)行了序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析，針對(duì)胰蛋白酶基因的共性進(jìn)行了詳盡的分析，期望能以此作為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探索胰蛋白酶基因的生物學(xué)功能。

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