張 瑞，李新霞，毛新民，趙海霞，李琳琳*(.新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，新疆烏魯木齊80054;.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，新疆烏魯木齊80054;.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆烏魯木齊80054)

新疆兩色金雞菊為菊科金雞菊屬一年生草本植物兩色金雞菊Coreopsis tinctoria Nutt.的干燥頭狀花序，俗名為昆侖雪菊，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效［1］，為維吾爾族世代傳承下來的一種養(yǎng)生、保健的天然植物，被當?shù)鼐用癞敾ú栾嬘茫芍委熢餆釤┛?、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒［2－3］;兩色金雞菊中含有黃酮、揮發(fā)油、多糖、皂苷、氨基酸等化學成分，但缺少具有代表性的單體成分的含量研究［4］。藥效藥理學研究主要集中于降壓、降脂和降糖相關(guān)的研究［5－7］，并認為其主要活性成分為黃酮類化合物，已研究表明兩色金雞菊中含有Flavanomarein和Marein，并認為是黃酮類化合物主要成分［6，8－9］。該試驗采HPLC法對兩色金雞菊提取物中黃酮類化合物Flavanomarein和Marein 2種成分同時進行檢測，為兩色金雞菊的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材 新疆兩色金雞菊采于新疆和田地區(qū)、喀什地區(qū)不同栽培基地，經(jīng)新疆醫(yī)科大學生藥教研室胡君萍教授鑒定為兩色金雞菊Coreopsis tinctoria Nutt.的干燥頭狀花序。

1.2 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)(ACQUITY，Empower工作站，Waters);色譜柱(Shim-pack VP-ODS，4.6 mm ×150 mm，5μm)，超聲儀(KQ-100)。

1.3 試藥 Flavanomarein(00006030-705，Chroma DEX，純度≥98%)和 Marein(00013126-604，Chroma DEX，純 度 ≥98%)，乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑為分析純。

1.4 方法

1.4.1 溶液的配置。

1.4.1.1 對照品溶液的制備。取Flavanomarein精密稱定后溶于適量二甲基亞砜后甲醇稀釋，使?jié)舛葹?.894 mg/ml，取Marein精密稱定后溶于甲醇，使?jié)舛葹?.700 mg/ml，保存于4℃冰箱中，備用。

1.4.1.2 供試品溶液的制備。取兩色金雞菊提取物約0.5 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入適量60%乙醇溶液，密塞，超聲(500 W，頻率100 Hz)處理30 min，冷卻，用60%乙醇定容至刻度線，搖勻，提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，置高速離心機中以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心15 min，取上清液1 ml定量轉(zhuǎn)移于10 ml容量瓶中，用60%乙醇溶液稀釋至刻度，混勻并用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4.2 色譜條件。Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流速1.0 ml/min;檢測波長 280 nm;柱溫 35 ℃;進樣量5 μl;流動相A為0.5%甲酸水溶液，pH為2.5;流動相B為乙腈，梯度洗脫程序如表1所示。

1.4.3 方法學考察。

1.4.3.1 標準曲線的繪制。配制Flavanomarein對照品溶液系列濃度11.788、47.152、117.880、188.608、235.760 μg/ml;Marein 對照品溶液系列濃度 17.00、34.00、102.00、170.00、238.00 μg/ml;精密吸取上述 5 種混標溶液各 5 μl，分別進樣。以對照品濃度C(μg/ml)為橫坐標、峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.3.2 精密度試驗。精密吸取同一供試品溶液5 μl于同一天內(nèi)連續(xù)進樣6次，記錄Flavanomarein、Marein的峰面積，得出日內(nèi)精密度并計算RSD值;精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進樣6 d，記錄Flavanomarein、Marein的峰面積，得出日間精密度并計算RSD值。

1.4.3.3 穩(wěn)定性試驗。精密吸取同一供試品溶液5 μl分別于配制后的 0、2、4、8、12、24 h 測定 Flavanomarein、Marein 面積積分值，并計算RSD值。

1.4.3.4 重復性試驗。稱取兩色金雞菊提取物(醇提物)0.5 g共6 份，精密稱定，按“1.4.1.2”項下制備樣品，分別測定Flavanomarein和Marein的平均含量并計算RSD值。

1.4.3.5 加樣回收率。精密量取已知含量的供試品溶液(含 Flavanomarein 21.788 μg/ml)共9 份，每份5 ml于 10 ml量瓶中，分別加入Flavanomarein對照品(Flavanomarein濃度為589.4 μg/ml)溶液 0.15、0.20、0.25 ml各 3 份，稀釋至刻度;精密量取已知含量的供試品溶液(含 Marein 101.3 μg/ml)共9份，每份1 ml于10 ml量瓶中，分別加入Marein對照品(Marein 濃度為 170 μg/ml)溶液 0.5、0.6、0.7 ml各 3份，稀釋至刻度，分別HPLC法測定，記錄峰面積，計算回收率和RSD。

1.4.4 樣品含量測定。取5 種提取物，按“1.4.1.2”項下制備樣品，按照“1.4.2”項的色譜條件進樣分析，平行3次測定Flavanomarein和Marein的平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品與供試品的高效液相色譜峰圖 在該色譜條件下，繪制對照品及供試品色譜圖(圖1)，由圖1可見，對照品及供試品中的Flavanomarein和Marein的保留時間分別為24.3 和45.5 min，經(jīng)計算樣品與其他組峰的分離度 ＞1.5，表明各組分分離度良好。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線的繪制。通過“1.4.2”色譜條件定量測定對照品，繪制標準曲線，數(shù)據(jù)經(jīng)過回歸處理，得Flavanomarein線性回歸方程為A=46 609C－205 798(r=0.999 9)，表明Flavanomarein 在濃度11.788 ～235.760 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;Marein線性回歸方程為A=8 712.9C－34 542(r=0.999 8)，表明 Marein 在濃度 17.000 ～238.000 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗。按“1.4.3.2”方法操作，計算得出 Flavanomarein和 Marein日內(nèi)精密度 RSD分別為 0.92%、0.18%，日間精密度分別為0.39%、0.10%，表明儀器比較穩(wěn)定，試驗符合要求。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗。按“1.4.3.3”方法操作，24 h 測定 Flavanomarein和Marein面積積分值，計算得出RSD分別為0.85%、0.95%，表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復性試驗。平行樣6份，測定Flavanomarein和Marein的平均含量分別為 10.948 、50.650 mg/g，RSD 分別為0.17%和0.51%，表明重現(xiàn)性良好。

2.2.5 加樣回收率。由表2和表3可見，F(xiàn)lavanomarein、Marein平均回收率分別為 97.09%、98.23%，RSD 分別為1.76%、0.48%，表明該方法回收率較好，方法可行。

表2 Flavanomarein加樣回收率結(jié)果

表3 Marein加樣回收率結(jié)果

2.3 樣品含量測定 由表4可見，5種提取物中乙酸乙酯提取物真空干燥粉所含的Flavanomarein和Marein的量較高，水提物真空干燥粉所含的Flavanomarein和Marein的量較少。

表4 兩色金雞菊5種提取物中Flavanomarein、Marein含量測定結(jié)果

3 討論

(1)該試驗在對照品的制備過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavanomarein對照品不易溶于甲醇，故在制備過程中先溶于適量二甲基亞砜后再用甲醇稀釋。

(2)該試驗對供試品溶液的處理方法進行了考察，通過甲醇、乙腈、乙腈－乙酸乙酯(1∶1)、60%乙醇及流動相作為溶劑進行了比較試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60%乙醇溶解樣品分離效果較好，最終確定用60%乙醇對樣品進行溶解。

(3)由樣品含量測定結(jié)果可知，5種提取物中Flavanomarein、Marein的含量是乙酸乙酯提取物＞醇提取凍干粉＞水提物，可能與Flavanomarein和Marein極性相關(guān)，推測2種化合物為脂溶性成分。

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