劉文寶　王清華　張敏　趙曉翠　張衛(wèi)華　王秀峰

摘要：CaRKNIF2是辣椒中受根結(jié)線蟲等多種生物逆境誘導(dǎo)表達(dá)的WRKY基因，但在我國重要的蔬菜作物番茄和茄子中缺乏相關(guān)研究。對(duì)蔬菜抗根結(jié)線蟲基因的鑒定和功能分析是進(jìn)行蔬菜抗線蟲分子育種的基礎(chǔ)。本研究利用比較基因組學(xué)的方法，從番茄和茄子的基因組中鑒定出與CaRKNIF2直系同源的基因，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、編碼蛋白的基序以及順式調(diào)控元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為深入解析番茄和茄子RKNIF2的功能提供了有益啟示。

關(guān)鍵詞：番茄；茄子；根結(jié)線蟲；RKNIF2；特征

中圖分類號(hào)：S641.201+S641.101

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2015）10-0013-04

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是一種固著性內(nèi)寄生植物線蟲，其分布廣泛且寄主種類繁多，是威脅蔬菜生產(chǎn)的主要病原物之一，也是導(dǎo)致蔬菜連作障礙的重要原因。根結(jié)線蟲不僅危害植株根部，破壞根組織的分化和生理活動(dòng)，影響地上部分生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)還會(huì)加重枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細(xì)菌病害的發(fā)生。選育抗根結(jié)線蟲蔬菜品種對(duì)于蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)環(huán)境、保障食品安全具有重要意義，而這有賴于蔬菜根結(jié)線蟲抗性基因的挖掘和抗性機(jī)理的研究。目前，蔬菜根結(jié)線蟲病的研究日益受到人們的重視，包括病原線蟲的分離鑒定和分子生物學(xué)研究、病原線蟲與寄主植物的互作、蔬菜抗根結(jié)線蟲基因的篩選克隆和分子標(biāo)記研究、蔬菜抗根結(jié)線蟲基因工程以及蔬菜根結(jié)線蟲防控技術(shù)等的報(bào)道越來越多。

WRKY是一類含有由約60個(gè)氨基酸殘基組成的WRKY結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和防衛(wèi)應(yīng)答中具有重要功能。研究表明，WRKY基因?yàn)榉袽i-1介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性表達(dá)所必需；而在擬南芥和黃瓜中也發(fā)現(xiàn)多個(gè)WRKY基因受根結(jié)線蟲調(diào)控表達(dá)；另外，擬南芥中AtWRKY23為甜菜孢囊線蟲取食點(diǎn)的建立所必需，而AtWRKY6等的下調(diào)表達(dá)對(duì)根結(jié)線蟲的發(fā)育有重要影響。這說明植物WRKY基因在根結(jié)線蟲抗性應(yīng)答過程中具有重要功能，值得深入探討。我國對(duì)于重要蔬菜作物番茄（Solanum lycopersicum）和茄子（Solanum melongena）有關(guān)WRKY基因與根結(jié)線蟲抗性的研究還很少。番茄和茄子基因組測(cè)序工作的完成為從基因組中鑒定和解析重要功能基因提供了便利。本研究利用比較基因組學(xué)的方法，從番茄和茄子基因組中各鑒定出一個(gè)與辣椒根結(jié)線蟲抗性應(yīng)答基因CaRKNIF2同源的WRKY基因SlRKNIF2和SmRKNIF2，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化、蛋白基序和順式作用元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為下一步解析SlRKNIF2和SmRKNIF2的功能提供了線索。

1研究方法

利用辣椒的CaRKNIF2基因序列做誘餌來搜索茄子基因組數(shù)據(jù)庫（http：//eggplant.kazusa.or.jp/blast.html）和NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome），鑒定番茄和茄子的RKNIF2基因。利用Mega 4.1軟件對(duì)SlRKNIF2和SmRKNIF2及其同源序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并將其編碼蛋白與CaRKNIF2基因的編碼蛋白進(jìn)行比較分析。利用motif-Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）對(duì)SlRKNIF2和SmRKNIF2的編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和基序分析。利用RKNIF2編碼區(qū)和基因組序列在線顯示基因外顯子和內(nèi)含子的組成（http：//gsdsl.cbi.pku.edu.cn/chinese.php）。根據(jù)編碼區(qū)序列和其所在scaffold序列得到SlRKNIF2和SmRKNIF2基因起始密碼子ATG上游1500bp的序列，利用PLANTCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）對(duì)SlRKNIF2和SmRKNIF2基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1SlRKNIF2和SmRKNIF2的鑒定及分子特征

利用比較基因組學(xué)的方法從番茄和茄子基因組中各鑒定出一個(gè)與辣椒RKNIF2直系同源的基因，分別命名為SIRKNIF2和SmRKNIF2（表1）。分析發(fā)現(xiàn)，它們的基因組序列都含有6個(gè)外顯子，且這6個(gè)外顯子的大小相似、排列一致（圖1）。SlRKNIF2和SmRKNIF2編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為1650bp和1605bp，預(yù)測(cè)編碼的蛋白都含有一個(gè)由61個(gè)氨基酸殘基組成的WRKY結(jié)構(gòu)域、一個(gè)Ⅱ類幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個(gè)甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域、3～4個(gè)糖基化位點(diǎn)、6～7個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)，此外，SmRKNIF2編碼的蛋白還含有一個(gè)谷氨酰胺富集區(qū)（表2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，SlRKNIF2和SmRKNIF2編碼的蛋白定位在細(xì)胞核中（表1），這與CaRKNIF2編碼蛋白定位的結(jié)果一致。

2.2SlRKNIF2和SmRKNIF2的系統(tǒng)進(jìn)化分析及序列比對(duì)

由圖2可知，SlRKNIF2和SmRKNIF2與CaRKNIF2基因在進(jìn)化上同屬一個(gè)類群。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SlRKNIF2和SmRKNIF2的編碼蛋白與CaRKNIF2編碼蛋白的序列一致性分別為86.45%和83.87%，其WRKY結(jié)構(gòu)域只有一個(gè)氨基酸殘基的差異，序列一致性均為98.36%；SlRKNIF2和SmRKNIF2編碼蛋白的序列一致性為85.23%，其WRKY結(jié)構(gòu)域的序列一致性為100%，說明它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上非常保守，可能具有相似的功能。endprint

2.3SlRKNIF2和SmRKNIF2順式作用元件分析及功能預(yù)測(cè)

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物表達(dá)調(diào)控的主要步驟，基因上游序列順式作用元件的分析可為研究基因的表達(dá)和功能提供重要線索。分析發(fā)現(xiàn)，在SlRKNIF2和SmRKNIF2的上游序列中存在多個(gè)順式作用元件，可應(yīng)答多種激素和非生物逆境（表3）。其中，兩基因均含有的元件有脫落酸應(yīng)答元件ABRE、真菌激發(fā)子應(yīng)答元件Box-W1、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif、熱脅迫應(yīng)答元件HSE、低溫應(yīng)答元件LTR、傷害和病原物應(yīng)答元件W-box，但其數(shù)目在兩基因中不盡相同；另外，SlRKNIF2上游序列中含有一個(gè)干旱誘導(dǎo)元件MBs和一個(gè)赤霉素應(yīng)答元件P-box，而SmRKNIF2上游序列中含有兩個(gè)病原物和防衛(wèi)應(yīng)答元件TC-rich repeats和兩個(gè)水楊酸應(yīng)答元件TCA-element。

對(duì)CaRKNIF2的研究表明，TMV、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉病菌以及信號(hào)分子水楊酸能快速而顯著地誘導(dǎo)CaRKNIF2的表達(dá)，茉莉酸甲酯能抑制它的表達(dá)，且CaRKNIF2在線蟲接種處理后的表達(dá)上調(diào)，在根尖組織中表達(dá)量最高；CaRKNIF2基因沉默的辣椒植株接種非毒性南方根結(jié)線蟲后根部卵塊數(shù)明顯增加，說明CaRKNIF2基因在植物根結(jié)線蟲抗性應(yīng)答過程中具有一定功能。根據(jù)序列比對(duì)和順式元件分析的結(jié)果，推測(cè)SlRKNIF2和SmRKNIF2基因可能具有與CaRKNIF2相似的功能。

3討論與結(jié)論

根結(jié)線蟲特別是南方根結(jié)線蟲因其寄主范圍廣，危害嚴(yán)重，已成為蔬菜可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。加強(qiáng)蔬菜根結(jié)線蟲抗性機(jī)制的研究，可為抗線蟲蔬菜分子育種提供優(yōu)異的目的基因和分子標(biāo)記，是解決蔬菜生產(chǎn)中線蟲危害的有效手段。本研究從番茄和茄子基因組中解析的RKNIF2基因與辣椒的CaRKNIF2基因直系同源，它們?cè)谶M(jìn)化上同屬一個(gè)類群，都含有6個(gè)外顯子，其編碼的蛋白都含有一個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，其上游序列中存在多個(gè)應(yīng)答不同逆境和激素的順式調(diào)控元件，暗示它們可能具有多樣的生物學(xué)功能。雖然番茄、茄子和辣椒的RKNIF2基因結(jié)構(gòu)非常保守，編碼蛋白的序列一致性也非常高，但是在WRKY結(jié)構(gòu)域內(nèi)，番茄和茄子與辣椒存在一個(gè)氨基酸殘基的差異，這種差異是否會(huì)影響基因的功能需要進(jìn)一步研究。另外，番茄和茄子RKNIF2基因在順式調(diào)控元件上存在較大差異，其編碼蛋白基序也有一定差異，這種差異對(duì)茄科不同物種RKNIF2的表達(dá)和功能有何影響，是下一步研究需要解決的重要問題。endprint