劉文寶　王清華　張敏　趙曉翠　張衛(wèi)華　王秀峰

摘要：CaRKNIF2是辣椒中受根結(jié)線蟲等多種生物逆境誘導(dǎo)表達的WRKY基因，但在我國重要的蔬菜作物番茄和茄子中缺乏相關(guān)研究。對蔬菜抗根結(jié)線蟲基因的鑒定和功能分析是進行蔬菜抗線蟲分子育種的基礎(chǔ)。本研究利用比較基因組學(xué)的方法，從番茄和茄子的基因組中鑒定出與CaRKNIF2直系同源的基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化、編碼蛋白的基序以及順式調(diào)控元件進行了系統(tǒng)分析，為深入解析番茄和茄子RKNIF2的功能提供了有益啟示。

關(guān)鍵詞：番茄；茄子；根結(jié)線蟲；RKNIF2；特征

中圖分類號：S641.201+S641.101

文獻標(biāo)識號：A

文章編號：1001-4942（2015）10-0013-04

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是一種固著性內(nèi)寄生植物線蟲，其分布廣泛且寄主種類繁多，是威脅蔬菜生產(chǎn)的主要病原物之一，也是導(dǎo)致蔬菜連作障礙的重要原因。根結(jié)線蟲不僅危害植株根部，破壞根組織的分化和生理活動，影響地上部分生長發(fā)育，同時還會加重枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細菌病害的發(fā)生。選育抗根結(jié)線蟲蔬菜品種對于蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護環(huán)境、保障食品安全具有重要意義，而這有賴于蔬菜根結(jié)線蟲抗性基因的挖掘和抗性機理的研究。目前，蔬菜根結(jié)線蟲病的研究日益受到人們的重視，包括病原線蟲的分離鑒定和分子生物學(xué)研究、病原線蟲與寄主植物的互作、蔬菜抗根結(jié)線蟲基因的篩選克隆和分子標(biāo)記研究、蔬菜抗根結(jié)線蟲基因工程以及蔬菜根結(jié)線蟲防控技術(shù)等的報道越來越多。

WRKY是一類含有由約60個氨基酸殘基組成的WRKY結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育和防衛(wèi)應(yīng)答中具有重要功能。研究表明，WRKY基因為番茄Mi-1介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性表達所必需；而在擬南芥和黃瓜中也發(fā)現(xiàn)多個WRKY基因受根結(jié)線蟲調(diào)控表達；另外，擬南芥中AtWRKY23為甜菜孢囊線蟲取食點的建立所必需，而AtWRKY6等的下調(diào)表達對根結(jié)線蟲的發(fā)育有重要影響。這說明植物WRKY基因在根結(jié)線蟲抗性應(yīng)答過程中具有重要功能，值得深入探討。我國對于重要蔬菜作物番茄（Solanum lycopersicum）和茄子（Solanum melongena）有關(guān)WRKY基因與根結(jié)線蟲抗性的研究還很少。番茄和茄子基因組測序工作的完成為從基因組中鑒定和解析重要功能基因提供了便利。本研究利用比較基因組學(xué)的方法，從番茄和茄子基因組中各鑒定出一個與辣椒根結(jié)線蟲抗性應(yīng)答基因CaRKNIF2同源的WRKY基因SlRKNIF2和SmRKNIF2，并對其基因結(jié)構(gòu)、遺傳進化、蛋白基序和順式作用元件進行了系統(tǒng)分析，為下一步解析SlRKNIF2和SmRKNIF2的功能提供了線索。

1研究方法

利用辣椒的CaRKNIF2基因序列做誘餌來搜索茄子基因組數(shù)據(jù)庫（http：//eggplant.kazusa.or.jp/blast.html）和NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome），鑒定番茄和茄子的RKNIF2基因。利用Mega 4.1軟件對SlRKNIF2和SmRKNIF2及其同源序列進行系統(tǒng)進化分析，并將其編碼蛋白與CaRKNIF2基因的編碼蛋白進行比較分析。利用motif-Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）對SlRKNIF2和SmRKNIF2的編碼蛋白進行結(jié)構(gòu)域和基序分析。利用RKNIF2編碼區(qū)和基因組序列在線顯示基因外顯子和內(nèi)含子的組成（http：//gsdsl.cbi.pku.edu.cn/chinese.php）。根據(jù)編碼區(qū)序列和其所在scaffold序列得到SlRKNIF2和SmRKNIF2基因起始密碼子ATG上游1500bp的序列，利用PLANTCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子區(qū)的順式作用元件進行預(yù)測分析。利用WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）對SlRKNIF2和SmRKNIF2基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預(yù)測。

2結(jié)果與分析

2.1SlRKNIF2和SmRKNIF2的鑒定及分子特征

利用比較基因組學(xué)的方法從番茄和茄子基因組中各鑒定出一個與辣椒RKNIF2直系同源的基因，分別命名為SIRKNIF2和SmRKNIF2（表1）。分析發(fā)現(xiàn)，它們的基因組序列都含有6個外顯子，且這6個外顯子的大小相似、排列一致（圖1）。SlRKNIF2和SmRKNIF2編碼區(qū)長度分別為1650bp和1605bp，預(yù)測編碼的蛋白都含有一個由61個氨基酸殘基組成的WRKY結(jié)構(gòu)域、一個Ⅱ類幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域、3～4個糖基化位點、6～7個豆蔻?；稽c，此外，SmRKNIF2編碼的蛋白還含有一個谷氨酰胺富集區(qū)（表2）。亞細胞定位預(yù)測顯示，SlRKNIF2和SmRKNIF2編碼的蛋白定位在細胞核中（表1），這與CaRKNIF2編碼蛋白定位的結(jié)果一致。

2.2SlRKNIF2和SmRKNIF2的系統(tǒng)進化分析及序列比對

由圖2可知，SlRKNIF2和SmRKNIF2與CaRKNIF2基因在進化上同屬一個類群。序列比對發(fā)現(xiàn)，SlRKNIF2和SmRKNIF2的編碼蛋白與CaRKNIF2編碼蛋白的序列一致性分別為86.45%和83.87%，其WRKY結(jié)構(gòu)域只有一個氨基酸殘基的差異，序列一致性均為98.36%；SlRKNIF2和SmRKNIF2編碼蛋白的序列一致性為85.23%，其WRKY結(jié)構(gòu)域的序列一致性為100%，說明它們在結(jié)構(gòu)上非常保守，可能具有相似的功能。endprint

2.3SlRKNIF2和SmRKNIF2順式作用元件分析及功能預(yù)測

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物表達調(diào)控的主要步驟，基因上游序列順式作用元件的分析可為研究基因的表達和功能提供重要線索。分析發(fā)現(xiàn)，在SlRKNIF2和SmRKNIF2的上游序列中存在多個順式作用元件，可應(yīng)答多種激素和非生物逆境（表3）。其中，兩基因均含有的元件有脫落酸應(yīng)答元件ABRE、真菌激發(fā)子應(yīng)答元件Box-W1、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif、熱脅迫應(yīng)答元件HSE、低溫應(yīng)答元件LTR、傷害和病原物應(yīng)答元件W-box，但其數(shù)目在兩基因中不盡相同；另外，SlRKNIF2上游序列中含有一個干旱誘導(dǎo)元件MBs和一個赤霉素應(yīng)答元件P-box，而SmRKNIF2上游序列中含有兩個病原物和防衛(wèi)應(yīng)答元件TC-rich repeats和兩個水楊酸應(yīng)答元件TCA-element。

對CaRKNIF2的研究表明，TMV、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉病菌以及信號分子水楊酸能快速而顯著地誘導(dǎo)CaRKNIF2的表達，茉莉酸甲酯能抑制它的表達，且CaRKNIF2在線蟲接種處理后的表達上調(diào)，在根尖組織中表達量最高；CaRKNIF2基因沉默的辣椒植株接種非毒性南方根結(jié)線蟲后根部卵塊數(shù)明顯增加，說明CaRKNIF2基因在植物根結(jié)線蟲抗性應(yīng)答過程中具有一定功能。根據(jù)序列比對和順式元件分析的結(jié)果，推測SlRKNIF2和SmRKNIF2基因可能具有與CaRKNIF2相似的功能。

3討論與結(jié)論

根結(jié)線蟲特別是南方根結(jié)線蟲因其寄主范圍廣，危害嚴(yán)重，已成為蔬菜可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。加強蔬菜根結(jié)線蟲抗性機制的研究，可為抗線蟲蔬菜分子育種提供優(yōu)異的目的基因和分子標(biāo)記，是解決蔬菜生產(chǎn)中線蟲危害的有效手段。本研究從番茄和茄子基因組中解析的RKNIF2基因與辣椒的CaRKNIF2基因直系同源，它們在進化上同屬一個類群，都含有6個外顯子，其編碼的蛋白都含有一個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，其上游序列中存在多個應(yīng)答不同逆境和激素的順式調(diào)控元件，暗示它們可能具有多樣的生物學(xué)功能。雖然番茄、茄子和辣椒的RKNIF2基因結(jié)構(gòu)非常保守，編碼蛋白的序列一致性也非常高，但是在WRKY結(jié)構(gòu)域內(nèi)，番茄和茄子與辣椒存在一個氨基酸殘基的差異，這種差異是否會影響基因的功能需要進一步研究。另外，番茄和茄子RKNIF2基因在順式調(diào)控元件上存在較大差異，其編碼蛋白基序也有一定差異，這種差異對茄科不同物種RKNIF2的表達和功能有何影響，是下一步研究需要解決的重要問題。endprint