Foundation item: Supported by the Foundation of the International Cooperation of Guangdong Provincial Department of Science and Technology(2012B050600011)

? 通信作者： 田聯(lián)房(1969-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事模式識別與人工智能研究.E-mail: chlftian@scut.edu.cn

光學(xué)顯微注射過程中人類卵細(xì)胞分割的實現(xiàn)*

秦傳波田聯(lián)房?杜啟亮

(華南理工大學(xué) 自動化科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510640)

摘要：針對卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射過程中人類細(xì)胞質(zhì)、注射針和卵細(xì)胞極體的分割問題,首先根據(jù)分割目標(biāo)形狀的差異性,采用骨架形態(tài)學(xué)算子提取感興趣區(qū)域;接著采用改進(jìn)的模糊聚類方法,依據(jù)局部灰度和局部方差特征對邊界模糊、噪聲較大的預(yù)處理圖像進(jìn)行粗分類;然后在模糊聚類的基礎(chǔ)上設(shè)定水平集初始化位置和演化控制參數(shù),實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)、極體和注射針的分割;最后針對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的部分注射針圖像,采用直接擬合標(biāo)記出完整注射針圖像.實驗測試結(jié)果表明,文中算法可以實現(xiàn)人類卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、極體和注射針的正確分割.

關(guān)鍵詞：卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射;骨架提取;分割;模糊c-均值;注射

基金項目：*廣東省科技廳國際合作項目(2012B050600011);高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師課題(20120172120032);華南理工大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2014ZZ0045);廣州市科信局國際合作項目(2012J5100001)

作者簡介：秦傳波(1982-),男,博士生,主要從事模式識別與人工智能研究.E-mail: tenround@163.com

文章編號：1000-565X(2015)05-0066-07

中圖分類號：TN391.41

doi:10.3969/j.issn.1000-565X.2015.05.011

收稿日期：2014-08-28

近年來,實現(xiàn)細(xì)胞顯微注射的自動化是當(dāng)前生物基因工程技術(shù)的重點研究方向.在卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)實驗裝置的研發(fā)上,國內(nèi)外已有學(xué)者展開基礎(chǔ)研究工作[1-4],搭建了基于光學(xué)顯微的注射平臺.而對于卵細(xì)胞的特征分析,Manna等[5]使用紋理特征實現(xiàn)對卵細(xì)胞的分類和選擇,為進(jìn)一步提高ICSI成功率做準(zhǔn)備.Basile等[6]通過圖像預(yù)處理從細(xì)胞質(zhì)中心開辟出一塊矩形區(qū)域,經(jīng)Harr小波變換后提取卵細(xì)胞的多個統(tǒng)計紋理特征,再用模糊c-均值(FCM)聚類實現(xiàn)不同程度顆粒度的卵細(xì)胞分類.Caponetti等[7-8]先用模糊數(shù)學(xué)方法實現(xiàn)分割,并結(jié)合紋理特征實現(xiàn)卵細(xì)胞分類,但運用Hough變換[9]實現(xiàn)圓形細(xì)胞質(zhì)的預(yù)分割,無法應(yīng)用到細(xì)胞形變的情況,并且沒有分割出細(xì)胞的極體.Boldak[10]提出了一種基于外部靜電聲力驅(qū)動的全局活動輪廓蛇模型,雖然分割出了細(xì)胞質(zhì)的輪廓,但要手動初始化演化輪廓,且沒有實現(xiàn)細(xì)胞極體的分割.對于注射針的運動控制,Zhang等[11]基于顯微視覺研究了對注射針移動的閉環(huán)控制方法,同時用卡爾曼濾波器實現(xiàn)注射針內(nèi)精子運動的定位和跟蹤.趙新等[12]對顯微圖像中顯微針深度信息進(jìn)行提取,并用吸持針和注射針對插實驗進(jìn)行了驗證.綜上所述,ICSI的各種實驗裝置和卵細(xì)胞的特征分析受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注,但有關(guān)卵細(xì)胞顯微注射過程中卵細(xì)胞的準(zhǔn)確分割和定位問題的研究鮮見報道,而這是細(xì)胞顯微注射自動化的關(guān)鍵所在.

為此,文中在形態(tài)學(xué)骨架提取的預(yù)處理基礎(chǔ)上,采用基于模糊聚類的水平集方法[13-14]來實現(xiàn)目標(biāo)分割.在ICSI圖像中,卵細(xì)胞的細(xì)胞壁和透明帶之間的寬度超過2個像素,可用形態(tài)學(xué)方法提取邊界且不被破壞.因此，文中首先運用二值形態(tài)學(xué)中骨架提取的思想實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和極體的粗分割,提取目標(biāo)中包含一段注射針末端和細(xì)胞質(zhì)的預(yù)處理圖像；考慮到預(yù)分割圖像強(qiáng)度不均勻、易受大量噪聲污染、顆粒度較強(qiáng)等問題,文中采用改進(jìn)的FCM算法,利用像素的局部灰度和空間信息進(jìn)行模糊聚類,實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)、極體和細(xì)胞內(nèi)注射針的粗分類.然后基于聚類結(jié)果實現(xiàn)水平集位置的初始化和設(shè)置水平集曲線演化的參數(shù)[15-17],實現(xiàn)目標(biāo)的正確分割,并依據(jù)分割結(jié)果通過直線檢測擬合出注射針的位置.最后采用文獻(xiàn)[18-21]算法和文中算法對光學(xué)顯微臨床圖像[22]進(jìn)行實驗,并比較其分割結(jié)果.

1基于模糊聚類的水平集分割

ICSI注射的情景如圖1所示.卵細(xì)胞注射主要分為人類卵細(xì)胞、注射針和吸附針3個對象.其中,卵細(xì)胞周邊模糊區(qū)域為透明帶,透明帶內(nèi)側(cè)黑色寬曲線帶為細(xì)胞壁,細(xì)胞壁所包圍的物質(zhì)為細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞質(zhì)的右上方圓形顆粒狀物質(zhì)為卵細(xì)胞的極體;吸附針用來吸附和固定卵細(xì)胞;長細(xì)條狀的顯微注射針用于精子的運輸和注射.在ICSI過程中需要確保注射針正確刺入細(xì)胞的位置,不能損害細(xì)胞的極體.極體是卵細(xì)胞成長過程中減數(shù)分裂的產(chǎn)物,為早期胚胎的發(fā)育提供能量貯備,對ICSI的成功率和嬰兒性別結(jié)果有較大的影響.同時在細(xì)胞注射過程中判斷是否真正刺穿細(xì)胞質(zhì).故實現(xiàn)卵細(xì)胞的分割至為重要.文中分割算法的流程如圖2所示.

圖1　細(xì)胞注射示例

1.1感興趣圖像預(yù)分割

Basile等[6]用模糊數(shù)學(xué)形態(tài)算子和Hough變換[9]實現(xiàn)卵細(xì)胞的預(yù)分割,但僅局限于處理圓形的卵細(xì)胞.在ICSI圖像中,卵細(xì)胞隨著注射針刺入而發(fā)生形變,Hough變換雖然可以檢測圓或橢圓,但無法在這種形變情況下進(jìn)行細(xì)胞分割.由于注射針的一段刺入卵細(xì)胞,而且細(xì)胞質(zhì)、注射針和極體的灰度值比較接近,細(xì)胞放射冠的邊緣也比較模糊,不宜用閾值分割方法實現(xiàn)分割.考慮到卵細(xì)胞的內(nèi)細(xì)胞壁形成的帶寬大于2個像素寬度,文中結(jié)合形態(tài)學(xué)算子和骨架提取的知識來實現(xiàn)目標(biāo)的粗分割.二值圖像骨架化可以將對象簡化為線條,但不修改圖像的基本結(jié)構(gòu),同時良好地保留圖像的基本輪廓.

圖2　文中分割算法流程圖

對圖3(a)所示原始圖像進(jìn)行預(yù)處理.首先，用最大類間方差法得到完整的二值圖像,經(jīng)膨脹操作后提取骨架,結(jié)果如圖3(b)所示.骨架化完整地保留了細(xì)胞質(zhì)、極體、吸附針和注射針的輪廓,其寬度為單個像素寬度,注射針骨架化為單像素直線,骨架化的圖像中細(xì)胞質(zhì)是連通的.其次,通過區(qū)域填充和標(biāo)記后,使用規(guī)則濾波器把卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)從周邊的對象背景中分離出來.最后,提取出感興趣區(qū)域(ROI),結(jié)果如圖3(c)所示.

圖3　圖像預(yù)處理

1.2改進(jìn)的模糊聚類算法

圖像預(yù)處理所提取的ROI圖像有3個分割對象:細(xì)胞質(zhì)、極體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一段注射針.ICSI圖像數(shù)據(jù)是從光學(xué)顯微鏡下采集得到的,存在光照不均和噪聲污染問題.傳統(tǒng)FCM性能指標(biāo)是一種全局能量方差最小的目標(biāo)代價函數(shù),當(dāng)出現(xiàn)異常點時有較差的聚類結(jié)果.而噪聲在現(xiàn)實生物醫(yī)學(xué)圖像中不可避免.因此,文中考慮加入局部特性[13-14],使當(dāng)前中心點像素的分類由其近鄰域內(nèi)像素的分類標(biāo)記共同決定,進(jìn)而改進(jìn)傳統(tǒng)FCM對噪聲敏感的問題.

假定采集到的實際圖像y由真實圖像x和偏置域b組成,且b在局部范圍內(nèi)是緩慢變化的,圖像y共有N個像素,那么有

yk=xk+bk,?k∈{1,2,…,N}

(1)

則標(biāo)準(zhǔn)的FCM目標(biāo)代價函數(shù)可寫成如下形式:

(2)

式中:p是模糊隸屬度加權(quán)指數(shù),影響最終分類的模糊程度;xq為真實圖像局部窗口內(nèi)第q個像素點;uik和vi分別是隸屬度和聚類中心;Rk表示以xk為中心的近鄰域;Nr是近鄰域Rk中像素的個數(shù);α是近鄰域的控制參數(shù),取值反比于圖像的信噪比.將式(1)代入式(2)得

(3)

式中,yq為采集圖像局部窗口內(nèi)第q個像素點,bq為偏置.

使用Lagrange乘子求式(3)的最優(yōu)問題:

(4)

(5)

(6)

同理,對偏置域bk進(jìn)行估計,求一階偏導(dǎo)數(shù)并令其結(jié)果為0,可以求得

(7)

對于每個像素點，在其5×5的近鄰域內(nèi)計算局部均值和局部方差，以此,為聚類特征.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)FCM聚類步驟進(jìn)行運算.對圖4(a)所示的預(yù)處理得到的ROI圖像,用改進(jìn)的模糊聚類算法進(jìn)行聚類,卵細(xì)胞質(zhì)和極體的聚類結(jié)果見圖4(b)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部基本平滑,邊界相對清晰,極體的主要邊界區(qū)域得以和細(xì)胞質(zhì)分離；ROI圖像中部分注射針的圖像見圖4(c),周邊的細(xì)胞輪廓可以在后續(xù)操作中去除.

圖4　基于ROI圖像的改進(jìn)FCM聚類結(jié)果

1.3結(jié)合模糊聚類的水平集模型

模糊聚類得到的結(jié)果是一個粗略的理想分類,可用聚類結(jié)果導(dǎo)出水平集演化的初始位置,從而減少曲線深化運算量,提高分割精度.水平集方法易于結(jié)合先驗知識來引導(dǎo)或驅(qū)動輪廓的演化.Li等[17]提出了無需初始化的變分水平集方法,其原始的變分方程為

(8)

(9)

式中,ν系數(shù)取值的正負(fù)決定初始輪廓相對于待分割目標(biāo)做收縮或膨脹演化,以及演化的速度.對于實際分割問題,期望遠(yuǎn)離目標(biāo)邊界時,演化速度快;反之,演化速度慢.當(dāng)輪廓跨過目標(biāo)邊界時,可以自動改變演化方向,而非一成不變.因此,自適應(yīng)地改變系數(shù)ν的取值，更適合實際分割需求,令模糊聚類隸屬度的圖像為I,那么對于圖像中像素k(其隸屬度為rk),有

νk=G(rk)=1-2rk,rk∈(0,1)

(10)

水平集的演變方程更新為

(11)

其他參數(shù)的選取如下[17]:

1.4水平集的初始化及演化

模糊聚類得到一個粗糙的分類結(jié)果后,可以從聚類結(jié)果導(dǎo)出水平集演化的初始位置,從而減少運算量.假設(shè)選定模糊聚類隸屬度的圖像為I,設(shè)定一個可調(diào)整的閾值,得到二值圖像像素:

(12)

那么,水平集初始化函數(shù)表達(dá)為

φ0=-4ε(0.5-Bk),ε=1.5

(13)

利用有限差分法實現(xiàn)數(shù)值化求解,時間偏導(dǎo)數(shù)值化采用前向差分,空間偏導(dǎo)數(shù)值化則采用中心差分[16].在聚類圖像的基礎(chǔ)上,文中分別基于卵細(xì)胞質(zhì)的聚類結(jié)果和注射針的聚類結(jié)果并結(jié)合水平集方程來實現(xiàn)分割.

圖5　細(xì)胞與注射針分割結(jié)果及水平集演化3D圖

Fig.5Segmentation results of cell and injection pipette and 3D photo of level set evolution

圖5(a)為細(xì)胞質(zhì)與極體的分割圖像,比較光滑和準(zhǔn)確地演化出邊界輪廓;圖5(b)為水平集演化的三維(3D)效果圖,3D圖中間空的斜長低谷為注射針圖像,其右下方相對獨立的一個小區(qū)為極體;圖5(c)為卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部一段注射針的分割結(jié)果.考慮到注射針的線性特點,文中在二值化的基礎(chǔ)上,并結(jié)合圖5(c)實現(xiàn)直線檢測.圖6(c)給出了注射針的完整分割圖像.

圖6　注射針的直線擬合

2實驗和結(jié)果討論

文中實驗所用光學(xué)顯微臨床圖像(大小為320×240)來源于美國佛羅里達(dá)州生殖科學(xué)和技術(shù)研究所[22]，運行環(huán)境Windows XP,Matlab R2011a,Pentium Dual CPU 3.2GHz,2GB內(nèi)存.

2.1ROI預(yù)分割提取

ICSI分為4個階段:準(zhǔn)備接觸、刺穿過程、注射和退針.在各階段細(xì)胞因注射針刺入而發(fā)生形變,形態(tài)由圓形變成近似橢圓.Hough變換能檢測出近似圓形輪廓[6-8],但對嚴(yán)重形變情況失效,故文中采用形態(tài)學(xué)骨架算子來提取感興趣目標(biāo).

圖7　ROI圖像提取預(yù)處理

預(yù)分割結(jié)果(見圖7)表明,在ICSI的各個階段可以完整獲取細(xì)胞質(zhì)和極體的粗輪廓,方法簡單而高效.退針情形與刺穿后和接觸階段類似,不再單獨展示.

2.2各聚類算法實驗結(jié)果對比

對于預(yù)分割ROI圖像,采用文中改進(jìn)的模糊聚類方法進(jìn)一步分割出細(xì)胞質(zhì)和極體的輪廓,同時分割出已經(jīng)刺入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部的部分注射針圖像,并與其他兩種聚類算法(傳統(tǒng)FCM聚類算法、均值漂移法[15])的分割結(jié)果(見圖8)進(jìn)行對比分析.從圖可知:由于圖像的顆粒度較大且灰度值相接近,傳統(tǒng)FCM聚類算法很難將細(xì)胞質(zhì)、極體和注射針區(qū)分開來;均值漂移法雖然可以實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和注射針的分類,但極體區(qū)域的分類較亂,且運算量大;文中算法因考慮了灰度局部特性而取得了良好的分割效果.

圖8　3種聚類算法的分割結(jié)果對比

Fig.8Comparison of segmentation results among three clustering algorithms

2.3各種水平集分割算法的對比

在ICSI的4個階段(準(zhǔn)備接觸、刺穿過程、注射和退針),分別采用4種水平集分割算法(C-V[18]、LBF[19]、LCV[20]、LIF[21])和文中算法進(jìn)行分割評估.每個階段用采集得到的30幅圖像做測試，即每種算法用120幅圖像做測試.分別統(tǒng)計4個階段中每種算法分割細(xì)胞質(zhì)和極體的成功率,結(jié)果見圖9.

圖9　幾種算法對細(xì)胞質(zhì)和極體的分割成功率比較

Fig.9Comparison of success rates of segmentation among several algorithms on polar and cytoplasm

由圖9(a)可知,在ICSI過程的4個階段,5種算法在刺穿階段和注射階段對細(xì)胞質(zhì)的分割成功率均下跌,但文中算法的分割成功率下跌幅度最小,成功率基本保持在90%以上.產(chǎn)生下跌的主要原因是注射針的刺入使細(xì)胞質(zhì)發(fā)生了彈性形變,注射針的灰度和細(xì)胞質(zhì)接近,且流動的細(xì)胞質(zhì)液體表現(xiàn)為圖像的噪聲.C-V、LBF和LCV算法的整體分割成功率波動較大,且基本上在60%以下,而在注射階段則遠(yuǎn)低于50%.相比于文中算法,LIF算法的分割成功率在刺穿和注射階段下降了10%～20%.這表明文中算法具有更好的魯棒性.

由圖9(b)可知,在ICSI過程的4個階段,5種算法在刺穿階段和注射階段對卵細(xì)胞極體的分割成功率依然下跌,但文中算法對極體的分割成功率基本上在90%以上且保持不變.與細(xì)胞質(zhì)的分割結(jié)果相比,LCV算法對卵細(xì)胞極體的分割成功率有較大的提升.C-V、LBF算法對極體的整體分割成功率波動較大,且基本上在40%以下;LIF算法對極體的分割成功率總體上低于80%,效果遠(yuǎn)低于對細(xì)胞質(zhì)的分割成功率.可見,文中算法取得了最穩(wěn)定的分割結(jié)果.

以刺穿狀態(tài)為例對各種算法的分割結(jié)果進(jìn)行對比分析.從圖10(b)可知,全局C-V模型沒有考慮局部強(qiáng)度的不一致性,故分割目標(biāo)雜亂,卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)長的條狀注射針的分割效果比較差，而且對于周邊噪聲較大的卵細(xì)胞極體,分離出來的可能性較小.從圖10(c)可知:LBF局部分割模型克服了分片常數(shù)C-V模型的不足，但局部信息的引入使得局部分割明顯存在局部小輪廓,卵細(xì)胞的極體出現(xiàn)過分割,且存在與細(xì)胞質(zhì)粘連現(xiàn)象,而對于周邊噪聲較大的卵細(xì)胞極體,則不能完全保證后續(xù)處理可以把極體從其周邊區(qū)域中分割出來;雖然注射針的輪廓相對清晰,但細(xì)胞質(zhì)充滿噪聲.從圖10(d)可知,LCV算法是在C-V模型的基礎(chǔ)上增加了局部信息,故可以分割出較完整的細(xì)胞極體,但卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射針的圖像噪聲較大,可以區(qū)分注射針的輪廓.從圖10(e)可知,LIF算法的運算高效且抗噪能力強(qiáng),能較好地分離細(xì)胞的極體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部的一段注射針輪廓，但存在極體和細(xì)胞粘連的情況.從圖10(f)可知，文中算法對極體和細(xì)胞質(zhì)的分割效果明顯，且在注射的4個階段均保持較好的分割效果.

圖10　不同算法的分割結(jié)果對比

Fig.10Comparison of segmentation results among different algorithms

針對ICSI中4個階段的各種形變情況，圖11給出了文中算法的分割結(jié)果.從圖11(a)可知，在注射針與卵細(xì)胞接觸狀態(tài),卵細(xì)胞本身只有極小的形變；從圖11(b)可知,注射針開始接觸卵細(xì)胞時,卵細(xì)胞本身有明顯的形變；從圖11(d)-11(e)可知,在注射針刺穿卵細(xì)胞的狀態(tài),卵細(xì)胞質(zhì)形態(tài)反彈,近似橢圓;退針狀態(tài)與圖11(f)的注射狀態(tài)相似.由上述過程可知,細(xì)胞質(zhì)和極體均得到獨立地分割,極體在注射過程中因受注射針擠壓卵細(xì)胞而產(chǎn)生形變，極體的圖像發(fā)生改變,導(dǎo)致分割結(jié)果略有形變.

圖11　文中算法在不同階段的分割結(jié)果

Fig.11Segmentation results of the proposed algorithm at diffe-rent stages

由于注射針的擠壓，卵細(xì)胞本體呈現(xiàn)形變相對嚴(yán)重的橢圓但細(xì)胞質(zhì)和極體均被完整地分割，基本上不存在錯誤分割的情況，表明文中算法具有極強(qiáng)的魯棒性.

3結(jié)論

針對ICSI卵細(xì)胞注射過程中的分割問題,文中先采用形態(tài)學(xué)骨架提取方法實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的初步分割，然后基于改進(jìn)的模糊聚類估計出近似輪廓并作為水平集的初始化位置，通過調(diào)整變分水平集模型的參數(shù)可實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)、極體和注射針的分割.直線檢測結(jié)果表明,文中算法可實現(xiàn)完整注射針的定位.今后擬實現(xiàn)序列圖像的實時跟蹤與分割，考慮將局部紋理特征作為先驗信息，依據(jù)目標(biāo)和背景的概率密度分布距離度量，并結(jié)合水平集方法來實現(xiàn)分割.

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Realization of Human Oocytes Segmentation in the Process

of Optical Micro-Injection

QinChuan-boTianLian-fangDuQi-liang

(School of Automation Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

Abstract:Aiming at the segmentation of human cytoplasm, injection pipette and egg polar body in the process of intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI), firstly, the operator of mathematical morphology is adopted to detect the region of interest according to the difference in shapes of segmentation targets. Secondly, according to local gray level and local variance,an improved fuzzy clustering method is used to implement the rough classification of preprocessing images with fuzzy boundaries and noises.Then,the level set algorithm is used to carry out the segmentation of cytoplasm,polar body and injection pipette, with its initialization location and controlling parameters being set according to fuzzy clustering results. Finally,line fitting is employed to mark the whole injection pipette from the local images of injection pipette inserted in cytoplasm.Experimental results show that the proposed algorithm can implement the segmentation of human oocyte cytoplasm,polar body and injection pipette correctly.

Key words: intra-cytoplasmic sperm injection;skeleton extraction;segmentation;fuzzyc-means;injection