劉勝男+張華+柳絮+李廣賢+楊永義+姚方印

摘要：本試驗以帶有華粳秈74遺傳背景的單片段代換系與華粳秈74雜交得到的F2代次級分離群體為試驗材料，利用與華粳秈74農藝性狀差異極顯著的單株進行重疊群作圖分析，在W06-40-48-06-2-l代換片段上鑒定出了一個株高QTL、一個粒長寬比QTL和一個千粒重QTL。

關鍵詞：水稻；單片段代換系；農藝性狀；重疊群作圖；QTL

中圖分類號：S511.032 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）04-0008-05

水稻是我國最重要的糧食作物之一，種植面積約占糧食作物總而積的百分之三十，產量近糧食總產量的一半[2]。水稻的許多性狀如抽穗期、株高、千粒重、粒長粒寬及其長寬比等都是數量性狀，這些數量性狀有較為復雜的遺傳基礎。對控制這些性狀的基因進行定位并研究其遺傳效應具有重要的理論和現實意義。目前有關水稻數量性狀的QTL定位有很多報道，但已克隆的基因相對較少，多數QTL不能深入研究。應用初級定位群體（F2、DH和RIL等）對QTL進行檢測相對比較容易，但由于材料的遺傳背景和群體大小的限制，定位得到的QTL置信區(qū)間往往很大，一般為10～30 cM，因此不能確定是單基因還是多基因的效應。而且，由于遺傳背景分離比較復雜，微效QTL表達效應容易受主效QTL表達的干擾，不能得到穩(wěn)定檢測。因此，利用初級群體為材料定位水稻數量性狀QTL精度較低，其結果可能與實際偏差較大[2]。為了消除QTL定位時遺傳背景產生的不利影響，提高檢測的靈敏度和定位的精確度，Tuinstra等[3]提出了一種思路和方法，利用相似遺傳背景下的次級群體進行QTL作圖。次級群體主要包括近等基因系（near-isogenic line，NIL）、染色體片段代換系（chromosome segment substitution line.CSSL）和導入系（introgression line，IL）等，這些次級群體的共同特點是遺傳背景相似，僅帶有的供體代換片段不同，應用這些次級群體對QTL進行鑒定和定位時，能提高定位與鑒定的精確度[4]。目前，已利用多個次級群體對水稻QTL進行精細定位與鑒定，例如，Yamamoto等[5]利用水稻單片段代換系精細定位了抽穗期基因Hd1、Hd2和Hd3；Takahashi等[6]定位了水稻抽穗期基因Hd6。由此可見，次級群體在作物QTL定位與檢測中有較高應用價值。

收稿日期：2014-12-10

基金項目：國家自然科學基金項目（31171529）；山東省農業(yè)生物資源創(chuàng)新利用課題；山東省農業(yè)科學院科技創(chuàng)新重點項目（2014CXZ10-2）；山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系（水稻）項目

千粒重（1 000-grain weight，KGW）是體現種子大小與飽滿程度的一項指標，是檢驗種子質量和作物考種的內容，也是田間預測產量的重要依據。對控制千粒重QTL的定位有利于從分子水平上探討其生理機理和遺傳機制，達到對產量和品質的合理調控[7]。株高與水稻的抗倒伏性顯著相關，因此株高對產量有重要的作用。20世紀60年代初，在世界范圍內掀起了一場綠色革命，倡導水稻矮稈化，大大提高了水稻產量，從而解決了多個發(fā)展中國家糧食自給問題。到目前為止，有很多定化水稻株高QTL的研究，水稻12條染色體上都分布著株高QTL。有研究者[8]采用Windows QTL Cartographer 2.5進行株高、千粒重的QTL分析，這兩個農藝性狀在抽穗期基因RFT1-Hd3a所處區(qū)間和Hd1所處區(qū)間均有顯著作用，并且兩個性狀在Hd1所處區(qū)間的作用均強于RFT1-Hd3a所處區(qū)間。粒長、粒寬及其長寬比是研究籽粒性狀的土要指標，其中粒長最能反映籽粒性狀。目前有很多關于水稻粒長、粒寬QTL定位的研究，其中有119個粒長相關QTL被定位，分布在水稻12條染色體上。很多研究結果顯示，一般在一個群體中能檢測到3～8個控制粒長的QTL，分布于2～5條不同的染色體上，隨著研究的不同，單個QTL的貢獻率差異也較大。有研究者[9]利用水稻JF171/Samba群體和JF222/JF178群體構建了兩個連鎖群，兩群體均在2號染色體上檢測到控制谷粒粒型和千粒重的主效QTL，位于2號染色體長臂中下部一個相對較小的區(qū)間RM263-RM318內，這些主效QTL以加性效應為主，圖譜距離約為18 cM、黃成[10]利用兩個粳稻品種沈農265和麗江新團黑谷進行雜交，構建了176株F2代次級分離群體，定位到5個控制粒長的QTL、4個控制粒寬的QTL、4個控制千粒重的QTL。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗單片段代換系W06-40-48-06-2-1和受體親本華粳秈74均由華南農業(yè)大學張桂權教授惠贈，單片段代換系W06-40-48-06-2-1的代換片段米源于供體Katy，位于第8染色體上，其余遺傳背景與華粳秈74相同。本試驗選用代換系W06-40-48-06-2-1與華粳秈74雜交得到的F2代次級分離群體作為試驗材料進行第8染色體上有關水稻株高、千粒重、谷粒粒型的QTL定位

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植 試驗在山東省農業(yè)科學院生物技術研究中心飲馬泉實驗場進行。分別在2013年4月20日播種、6月2日插秧和2014年4月28日播種、6月1日插秧，以株距15 cm、行距25 cm插秧種植，正常田間管理。

1.2.2 指標測量 株高：株高是水稻成熟期之后從莖基部至穗頂部的高度，每株測量兩次，取平均值作為株高。千粒重：水稻成熟后于室內選擇100粒已烘干飽滿的種子，用天平稱重，并折算成千粒重。粒長：每個樣品隨機挑選出10粒成熟飽滿的種子，首尾相連，不重疊放在坐標紙上排成行，測量其長度，重復兩次，求平均值即為粒長粒寬：每個樣品隨機挑選出10粒成熟飽滿的種子，并排放在坐標紙上排成一行，測量其寬度，重復兩次，求平均值即為粒寬。谷粒的長度比即為谷粒粒型。endprint

1.2.3 QTL鑒定 通過t測驗比較單片段代換系W06-40-48-06-2-1與受體親本華粳燦74之間的差異顯著性，以華粳秈74多個小區(qū)的觀察值合并為一個群體作對照。進行QTL鑒定時，當單片段代換系的某個性狀與對照同一性狀之間t測驗的概率值P≤0.0001時，則認定該單片段代換系內的代換片段上存在一個該性狀的QTL。

1.2.4 QTL加性效應值的估算方法 本試驗參照Eshed & Zamir（1995）的方法估算各個QTL的加性效應值及加性效應貢獻率。所用公式為：

加性效應值=（純合SSSL的表型值-對照的表型值）/2；

加性效應貢獻率（%）=（加性效應值/對照的表型值）×100。

1.2.5 微衛(wèi)星標記分析 根據本實驗室構建的微衛(wèi)星標記圖譜，選擇代換片段上的35對微衛(wèi)星標記對代換系和華粳秈74進行多態(tài)性檢測。篩選出在兩親本間具有多態(tài)性的引物，利用多態(tài)性引物對單株進行擴增，帶型結果以數字表示：“1”表示基因型與華粳秈74親本相同，“3”表示與單片段代換系親本相同，“2”為雜合帶型。所有引物郁是由上海生工合成。

1.2.6 重疊群作圖 重疊群作圖法是利用有重疊區(qū)域的代換片段進行QTL定位的方法。其原理如圖1，sssL1和SSSL2在M2M3區(qū)段相互重疊，在進行QTL鑒定時如果在SSSL1上檢出某個性狀的QTL而在SSSL2上未檢出，則認為這個QTL在M1M2區(qū)段上（Q1）；如果在SSSL1和SSSL2上同時檢出某個性狀的QTL，則認為這個QTL在M2M3區(qū)段上（Q2）；如果在SSSL2上檢出某個性狀的QTL而在SSSL1上未檢出，則認為這個QTL在M3M4區(qū)段上（Q3）。

2 結果與分析

2.1 QTL鑒定

對10株代換系W06-40-48-06-2-1和10株華粳秈74株高、千粒重、粒長寬比進行測量，P值分別為1.92×10-5、1.37×10-6、1.41×10-5，均小于0.0001，說明代換系的代換片段上存在一個株高QTL，命名為qPH8；一個千粒重QTL，命名為qKGW8；一個粒長粒寬QTL，命名為qGS8。

選取F2代次級分離群體中極端株高13株（1～13），對株高QTL進行加性效應分析（表1）。從F2代次級分離群體中隨意挑選10株，測量千粒重、粒長粒寬，選擇與華粳秈74有顯著差異的單株（千粒重和粒型單株各4株），并對其進行千粒重和粒型QTL的加性效應分析（表2、3）。

2.2 用于重疊群作圖的F2代單株代換片段的確定

根據本實驗室構建的微衛(wèi)星標記圖譜，選擇親本代換片段上的35對微衛(wèi)星標記對代換系和華粳秈74進行多態(tài)性檢測，篩選出在兩親本間具有多態(tài)性的引物RM152、PSM151、PSM155、RM25、RM547、RM72、RM404。利用7對多態(tài)性引物對21個F2代單株（同表1、2、3）進行擴增，基因型檢測結果如表4，單株的代換片段如表5。每一單株都含有一條代換片段。

2.3 重疊群作圖

利用編號為1～13的F2單株進行重疊群作圖，qPH8被界定在笫8染色體PSM155和RM547兩標記之間，估計長度約7.7 cM（圖2）。攜帶qPH8等位基因的單株在其他條件相同的情況下株高高于受體華粳秈74，說明等位基因qPH8具有促進受體親本華粳秈74長高的效應，其加性效應值介于9.0～13.0 cm之間（表1）。

利用編號為F2027和F2051的4個F2單株進行重疊群分析，qKGW8介于笫8染色體分子標記PSM151和RM547之間，兩標記之間的估計長度為20.2 cM（圖2）。攜帶qKGW8等位基因的4個單株平均粒重都重于受體華粳秈74，說明等位基因qKGW8能夠促使華粳秈74千粒重效應值增加，其加性效應為1.04～1.57 g（表2）。

利用編號為F2023的4個F2單株形成重疊群，qGS8介于第8染色體分子標記PSM155和RM25之間，兩標記之間的估計長度為3.0 cM（圖2）。攜帶qGS8等位基因的4個單株粒長寬比都大于受體華粳秈74，說明等位基因qGS8能夠促使華粳秈74粒長寬比效應值增加，其加性效應為0.095～0.205（表3）。

3 討論

利用單片段代換系進行QTL定位與傳統(tǒng)的定位方法相比具有很大的優(yōu)勢，單片段代換系只帶有一個供體片段，其它組成與受體基因組完全相同，這一特點消除了遺傳背景及QTL之間的相互干擾，使QTL的定位更精確。在單片段代換系構建過程中，復雜性狀的QTL被分解為多個單一的Mendel因子，利用重疊群定位可以把QTL定位在較小的區(qū)域內。此外，單片段代換系在遺傳上更穩(wěn)定，可以多地點、多季節(jié)、多年用于QTL分析。

本試驗利用重疊群作圖在代換片段上找到一個株高QTL（qPH8）、一個千粒重QTL（qKGW8）和一個粒型QTL（qGS8），為其精細定位及基因克隆奠定基礎。qGS8、qPH8和qKGW8在第8染色體上的位置與功能均和已克隆的抽穗期基因Ghd8相似，Ghd8對水稻抽穗期和產量性狀兼具主效作用，其遲熟等位基因提高株高、每穗實粒數、每穗總粒數和產量[3]。endprint