梁寶萍，宋佳靜，原玉香，張曉偉*，姚秋菊，張 強(qiáng)，趙艷艷

(1.駐馬店市農(nóng)科院，河南駐馬店463000;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，河南鄭州450008)

大白菜是我國(guó)栽培和食用面積最大的蔬菜［1］，其遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究一直受到高度重視［2］。對(duì)于白菜的分類有表型形態(tài)的分類，也有從細(xì)胞學(xué)水平分類［3］，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，采用分子生物學(xué)方法研究大白菜起源演化和分類［4－6］較多。研究大白菜遺傳多樣性可以克服雜交組合組配的盲目性和提高育種效率［7］。白菜具有自交不親和的特性，屬于天然異花授粉植物，在自然環(huán)境條件下很容易“串粉”［8］。因此，白菜親緣關(guān)系復(fù)雜，分類多樣化。但通過小孢子培養(yǎng)的大白菜可以獲得單倍體植株［9］，然后通過自然加倍或人工加倍得到DH(雙單倍體)系，不僅不受環(huán)境條件的影響，而且可以進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)不斷固定遺傳信息，有利于拓寬種質(zhì)資源，克服雜交組合組配的盲目性和提高育種效率。筆者主要利用SSR分子標(biāo)記的方法，對(duì)大白菜的2個(gè)DH系群體內(nèi)遺傳多樣性進(jìn)行標(biāo)記，從分子水平上分析DH系群體內(nèi)的遺傳關(guān)系，為大白菜育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為大白菜的2個(gè)品種經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的2個(gè)DH系群體，分別是Y360(60份材料)、YF05(44份材料)，均為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供，所有試驗(yàn)均在河南省農(nóng)科院園藝所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和蔬菜試驗(yàn)田進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。采用CTAB法提取各株系幼嫩葉片DNA。

1.2.2 SSR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。PCR反應(yīng)總體積為20 μl，其中 dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1U，Mg2+2.5 mmol/L，10 × PCR Buffer 2 μl，上下游引物為0.25 μmol/L，模板 DNA 5 μl(10 ng/μl)，ddH2O 補(bǔ)足至 20 μl。PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理。擴(kuò)增產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)，AgNO3染色。數(shù)據(jù)采用人工計(jì)帶法，為減小誤差，記錄清晰可辨的條帶，任一位點(diǎn)若有一個(gè)或一個(gè)以上個(gè)體不同于其他個(gè)體的位點(diǎn)記為一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。對(duì)于同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，按擴(kuò)增條帶的有無計(jì)算，同一位置上遷移率相同清晰的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”。建立0/1距陣。

1.2.4 親緣關(guān)系分析。據(jù)“1.2.3”建立的0/1矩陣，利用DPS 7.05版軟件，形成下三角，構(gòu)建聚類圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選 通過田間觀察，從大白菜DH系材料中選擇表型性狀差異較大的4份材料，對(duì)122對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選，從篩選的SSR引物中挑選擴(kuò)增效果好、多態(tài)性好和充分覆蓋全基因組的引物12對(duì)(表1)。

2.2 SSR的擴(kuò)增效果 Y360(60份)總共擴(kuò)增出37條帶，29條多態(tài)帶，多態(tài)性比率為78.0%;YF05(44份)總共擴(kuò)增出41條帶，36條多態(tài)帶，多態(tài)性比率為87.8%?？傮w而言，2個(gè)DH系群體材料的多態(tài)性較好(圖1)，遺傳多樣性較豐富。

表1 引物信息

2.3 大白菜DH群體遺傳多樣性分析 從圖2可以看出，大白菜DH系Y360群體在遺傳距離0.43處分為9個(gè)類群，遺傳距離在0～0.71，平均相異系數(shù)為0.553 2。大白菜DH系YF05聚類圖(圖3)在遺傳距離為0.70處分為2個(gè)類群，遺傳距離在0.08～ 0.77，平均相異系數(shù)為0.6313。第一類群材料數(shù)量占整個(gè)YF05群體的93%，此類群的材料葉面都有茸毛，第二類群材料葉面都無茸毛。

3 討論

該研究的DH系群體內(nèi)有不同程度的變異，這與王濤濤等［10］研究的2個(gè)大白菜DH系群體內(nèi)遺傳多樣性分析結(jié)論相一致。在該試驗(yàn)中YF05、Y360的多態(tài)性比率分別是87.8%，78.0%，表明遺傳變異程度YF05大于Y360。YF05 DH系群體遺傳變異的可能原因有2個(gè):第一，YF05的雙親性狀是兩個(gè)極端，如一個(gè)雙親的種子顏色是黑色，另一個(gè)是黃色;一個(gè)葉表沒毛，一個(gè)有毛;花色一個(gè)是黃色，另一個(gè)是白色;抱球類型一個(gè)是合抱，另一個(gè)是疊抱;一個(gè)耐抽薹，另一個(gè)易抽薹。第二，2個(gè)親本的來源分別是日本和中國(guó)。另DH系Y360群體內(nèi)部有遺傳距離為0的情況(如360-1與Y360-122，Y360-25與Y360-72)。就該試驗(yàn)而言，遺傳距離為0并不能說明它們之間遺傳背景完全相同，可以認(rèn)為試驗(yàn)中所用引物標(biāo)記的相同位點(diǎn)較多。所用標(biāo)記引物不能區(qū)分此類材料，也可能是所用引物標(biāo)記的數(shù)量性狀位點(diǎn)較近導(dǎo)致遺傳距離較小等原因。對(duì)不同作物的遺傳多樣性研究中，遺傳距離為0的情況也存在很多，如在高粱等作物中存在遺傳距離為0 的情況［11］。

圖1 SSR引物KBRH043E對(duì)YF05 DH群體的擴(kuò)增電泳圖譜

圖2 Y360 DH系群體聚類圖

圖3 YF05 DH系群體聚類圖

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