黃國文，管天球，趙雨云，陳莫林，劉宏輝 (湖南科技學院生化系，湖南永州425199)

何首烏［Fallopia multiflora(Thunb.)Harald］為雙子葉蓼科多年生草本植物，分布在我國廣東、四川、湖南等省區(qū)，生長于灌木叢中、山腳陰處或石隙中。莖纏繞，基部中空，多分枝，基部木質(zhì)化。葉心形，兩面光滑，有膜質(zhì)短筒狀的托葉鞘，圓錐狀花序。瘦果橢圓形，光滑，黑色［1］。塊莖供藥用，有滋補強壯作用，莖藤可治失眠癥［2］。野生何首烏的塊莖生長緩慢，不能滿足人類對藥物的開發(fā)利用。植物原生質(zhì)體培育和融合是植物育種的重要技術(shù)之一。目前分離原生質(zhì)體的方法有機械法和酶法，常用的方法是酶法。筆者用機械法制備何首烏葉片的原生質(zhì)體，用PEG結(jié)合高Ca2+-高pH誘導融合法來融合其原生質(zhì)體，以期為何首烏多倍體植株的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。何首烏新鮮成熟葉片。

1.1.2 主要儀器。血細胞計數(shù)板，光學顯微鏡，離心機，數(shù)碼相機。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備。用機械法制備原生質(zhì)體，具體操作步驟見文獻［3］。何首烏葉片經(jīng)過質(zhì)壁分離一定時間后切成0.5 cm寬的長條，轉(zhuǎn)入到25%蔗糖溶液中放置8 min，過濾后得到原生質(zhì)體溶液。原生質(zhì)體經(jīng)過27%蔗糖溶液洗滌一次，再用13%甘露醇CPW溶液懸浮。懸浮液原生質(zhì)體可用牛氏記數(shù)板記數(shù)和細胞融合。原生質(zhì)體得率=記數(shù)室大方格原生質(zhì)體的平均個數(shù)×104個(FW)。

1.2.2 滲透劑的選擇。以 0.9 mol/L NaCl、6%KNO3和35%蔗糖溶液作為高滲溶液，在35℃水浴鍋中處理何首烏葉片30 min后，制備原生質(zhì)體，計算原生質(zhì)體的得率，確定制備原生質(zhì)體的滲透劑類型。

1.2.3 影響原生質(zhì)體得率的測定方法。設(shè)定原生質(zhì)體質(zhì)壁分離的蔗糖濃度為25%、30%、35%、40%、45%，處理溫度為4、15、25、35、45 ℃，處理時間為10、30、50、70、90 min。將何首烏葉片放置在特定蔗糖濃度和特定溫度的條件下處理一定時間，葉片經(jīng)過切條后獲得原生質(zhì)體，測定原生質(zhì)體的得率。

1.2.4 PEG結(jié)合高Ca2+-高pH誘導法融合原生質(zhì)體的方法。經(jīng)過質(zhì)壁分離法獲得的原生質(zhì)體溶液，1 500 r/min下離心8 min，沉淀用少量13%甘露醇CPW溶液懸浮，為原生質(zhì)體溶液。用吸管取原生質(zhì)體懸浮液滴兩滴在載玻片上，靜置幾分鐘，使原生質(zhì)體在載玻片上產(chǎn)生一薄層。取特定濃度PEG融合液兩滴，緩慢滴加到載玻片上的原生質(zhì)體溶液中，再靜置一定時間，觀察載玻片原生質(zhì)體間的粘連。每隔5 min，用吸管向原生質(zhì)體液中滴兩滴高Ca2+-高pH溶液，共3次。蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液即成臨時裝片。用顯微鏡觀察細胞融合，統(tǒng)計融合百分數(shù)。用數(shù)碼照相機在顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 滲透劑對原生質(zhì)體得率的影響 用0.9 mol/L NaCl、6%KNO3和35%蔗糖溶液作為何首烏葉片質(zhì)壁分離的高滲溶液，在25℃下制備的原生質(zhì)體數(shù)量分別為0.9×105、3.8×105和5.8×102個/g(FW);且KNO3溶液會引起葉片流出物大量成塊，可能是原生質(zhì)體數(shù)量減少的原因。NaCl溶液處理的葉片制備的原生質(zhì)體溶液雖然雜物少，但相對蔗糖溶液而言細胞也較少。因此，以35%蔗糖溶液作為高滲溶液處理何首烏葉片制備的原生質(zhì)體數(shù)量較多，可用于制備原生質(zhì)體的條件優(yōu)化。

2.2 蔗糖濃度對原生質(zhì)體得率的影響 在25℃水浴鍋中用濃度分別為25%、30%、35%、40%、45%蔗糖溶液處理何首烏成熟葉片30 min后，制備原生質(zhì)體。測定原生質(zhì)體得率分別為100、2.3 ×104、3.5 ×105、2.2 ×105、0.5 ×104。可見，原生質(zhì)體數(shù)目隨著蔗糖濃度的增加先升高后降低。25%蔗糖溶液處理制備的原生質(zhì)體得率最少，為何首烏葉片細胞的低滲溶液。35%蔗糖溶液處理制備的原生質(zhì)體得率最多。當蔗糖濃度高于35%時，得到的原生質(zhì)體數(shù)量逐漸減少，可能是細胞失水過快過多導致細胞質(zhì)壁分離復原活性降低的原因。

2.3 溫度對原生質(zhì)體得率的影響 在5份35%蔗糖溶液燒杯中加入等量何首烏成熟葉片，分別放在4、15、25、35、45℃的水浴鍋中處理30 min后，制備原生質(zhì)體。測定原生質(zhì)體得率分別為70、0.4 ×103、5.7 ×105、2.3 ×105、1.3 ×103?？梢姡|(zhì)壁分離溫度影響原生質(zhì)體得率，在25℃時處理的材料得到的原生質(zhì)體數(shù)量最多，溫度過高或者過低得到的原生質(zhì)體數(shù)量減少。說明溫度影響細胞內(nèi)滲透壓的變化。溫度過低，細胞活性低，導致細胞失水少，質(zhì)壁分離的細胞數(shù)目少，因此制備的原生質(zhì)體數(shù)目少;溫度過高，細胞內(nèi)的活性過高，導致細胞失水過快過多，質(zhì)壁分離的細胞數(shù)目多，但細胞復原活性降低，甚至引起細胞活性喪失，因此制備的原生質(zhì)體數(shù)量少。

2.4 質(zhì)壁分離時間對原生質(zhì)體得率的影響 用35%蔗糖溶液在25 ℃下處理何首烏葉片10、30、50、70、90 min 后，制備原生質(zhì)體。測定的原生質(zhì)體的得率分別為2.7×102、3.2×105、3.4 ×105、4.1 ×105、3 ×104。表明蔗糖處理時間影響原生質(zhì)體得率。蔗糖處理時間過短或者過長，原生質(zhì)體的得率減少。因此質(zhì)壁分離時間決定原生質(zhì)體質(zhì)壁分離復原的活性，從而影響原生質(zhì)體的產(chǎn)率。在35%蔗糖溶液處理70 min時原生質(zhì)體得率最多(圖1A)?？紤]到原生質(zhì)體脫水時的生理活性變化，為了更好地保持原生質(zhì)體的活力，選擇以35%蔗糖溶液在25℃下處理30 min時制備的原生質(zhì)體，經(jīng)過離心用13%甘露醇CPW溶液懸浮后用于融合研究。

2.5 融合液PEG濃度和處理時間對原生質(zhì)體融合的影響 以PEG結(jié)合高Ca2+-高pH方法融合原生質(zhì)體，變化PEG融合液中PEG溶度，分別為10%、20%、30%、40%，分別處理35%蔗糖溶液制備的原生質(zhì)體15、20、25、30 min，觀察各種條件下原生質(zhì)體的融合效果(表1)。在20%PEG溶液條件下，融合20 min后，原生質(zhì)體的融合效率最高，為11.7%。PEG之所以能介導原生質(zhì)體融合，是因為在高濃度的PEG溶液中，PEG與水之間的氫鍵結(jié)合，使溶液中自由水消失，導致原生質(zhì)體發(fā)生膜結(jié)構(gòu)變化，促使其發(fā)生融合［4］。當PEG濃度大于20%時，PEG濃度越高和處理時間越長，融合率越低。PEG濃度過高和時間過長，可能使原生質(zhì)體反應(yīng)液環(huán)境黏滯度過高，阻礙高鈣－高PH溶液的洗滌作用，導致細胞融合減少。另外，PEG濃度過高，可能會使細胞體積減小，導致各細胞之間膜的接觸面減少，細胞融合效率降低。

表1 不同PEG濃度處理條件下原生質(zhì)體融合效率 %

20%PEG融合液融合原生質(zhì)體20 min，在顯微鏡(400×)下觀察到原生質(zhì)體粘連在一起(圖1B)。經(jīng)過3次高Ca2+-高pH溶液洗滌后，在顯微鏡下觀察到2個原生質(zhì)體融合現(xiàn)象(圖1C)，融合率為11.7%，沒有觀察到3個細胞的融合現(xiàn)象。但在各種條件下用高Ca2+-高pH溶液洗滌聚集的原生質(zhì)體時都發(fā)現(xiàn)大部分原生質(zhì)體被成塊地沖向一邊，只有少量的原生質(zhì)體在原位，這可能是原生質(zhì)體融合效率不高的原因。

圖1 何首烏葉片的原生質(zhì)體制備和融合現(xiàn)象

3 討論

植物原生質(zhì)體的制備有機械法和酶法［5］。由于酶解法操作簡單方便，獲得的細胞數(shù)量多，大多數(shù)研究采用酶解法，但酶解法中使用的各種酶可能對分離的原生質(zhì)體及其成分有作用會引起不良后果［6］。機械法是將葉片放入高滲溶液中進行質(zhì)壁分離一段時間，然后采用切條或者研磨的方法將葉片破裂，然后將碎塊放入低滲溶液中使細胞分離出來的方法。用此種方法制備原生質(zhì)體所用的時間短，成本低，沒有受到酶等化學試劑的影響，能夠保持細胞的原有狀態(tài)，是一種值得研究的方法。但目前認為機械法制備原生質(zhì)體數(shù)量少，不能用于細胞下游試驗。該研究根據(jù)細胞質(zhì)壁分離和復原的原理［7－8］，以蔗糖溶液作為葉片細胞質(zhì)壁分離的滲透劑，對蔗糖濃度、質(zhì)壁分離時間和溫度進行了多個水平試驗，用切條辦法破碎細胞，用能夠保持原生質(zhì)體活性的溶液13%甘露醇CPW溶液作為質(zhì)壁分離復原的試劑，分離到數(shù)量較多的原生質(zhì)體。該試驗結(jié)果表明，在25℃條件下將何首烏葉片浸入35%蔗糖溶液處理30 min能夠分離3.2×105個/g(FW)。這些原生質(zhì)體經(jīng)過20%PEG融合液作用20 min，用高Ca2+-高pH溶液洗滌誘導融合，能夠得到11.7%的2個原生質(zhì)體融合的細胞融合體，說明用此種方法制備的原生質(zhì)體也是有活性的;同時說明融合效率不高，有待于進一步研究。該研究結(jié)果為何首烏植株的細胞育種研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

［1］中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒［M］.北京:科學出版社，1972:567.

［2］王文靜，薛詠梅，趙榮華，等.何首烏的化學成分和藥理作用研究進展［J］.云南中醫(yī)學院學報，2007，30(3):62 ～63.

［3］黃國文.野燕麥原生質(zhì)體制備和融合的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41(23):9546－9547.

［4］復鎮(zhèn)澳.第九講 植物原生質(zhì)體融合和細胞雜交［J］.植物生理通訊，1979(3):58－66.

［5］張良波，李培旺，黃振，等.木本植物原生質(zhì)體制備體系的研究發(fā)展［J］.中南林業(yè)科技大學學報，2011，31(8):102 －106.

［6］AHUIA M R，龐廣昌，胡前進.原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)和融合技術(shù)的現(xiàn)狀及其展望［J］.國外林業(yè)，1983(4):10 －11.

［7］顧怡，胡興昌.應(yīng)用NaCl進行“植物細胞質(zhì)壁分離及復原實驗”的探索［J］.生物學教學，2012，37(6):47.

［8］楊培俊，趙吉勇.探究植物細胞在KNO3溶液中的質(zhì)壁分離與復原的最佳濃度［J］.生物學教學，2008，33(8):45－46.