蘇詩茜,孫海瓊,劉少楠,蘇秋鈺,崔岱宗*
(1.黑龍江省實驗中學,黑龍江哈爾濱150001;2.東北林業(yè)大學,黑龍江哈爾濱150040)
漆酶(EC 1.10.3.2)是一種多銅氧化酶,能夠?qū)⒀鯕膺€原為水,同時介導芳環(huán)化合物的氧化。漆酶對底物的特異性低,能氧化多種污染物,在廢水處理和生物修復方面具有很大的潛力[1]。工業(yè)生產(chǎn)的條件比較苛刻。在高溫、極酸或極堿的環(huán)境下[2],要求有極高穩(wěn)定性的漆酶。與細菌漆酶相比,雖然真菌漆酶氧化還原能力較強,產(chǎn)量較高[3],但是其穩(wěn)定性比較低,pH范圍比較窄,而且活性易受鹽溶液的影響[4]。近年來,細菌漆酶以其固有的熱和堿性pH穩(wěn)定性作為具有潛力的生物催化劑而被廣泛研究[5]。
染料被應用于紡織、皮革、醫(yī)藥、化妝品和塑料工業(yè)。大多數(shù)染料由于其復雜的化學結構而具有毒性,并且不易被降解。工業(yè)上的染料廢水對人類的健康有很大的危害[6]。采用生物酶法處理染料廢水比采用物理、化學方法處理具有節(jié)約成本的優(yōu)勢[7]。漆酶能使多種合成染料脫色[8],對環(huán)境污染的治理具有潛在的意義。筆者從東北林業(yè)大學實驗林場的土壤中分離出一株具有漆酶活性的新菌株。它對三苯甲烷類和蒽醌類染料具有較高的脫色率。
1.1 材料 菌株10`ZS由從東北林業(yè)大學實驗林場樟子松林下的土壤中分離。
1.2 方法
1.2.1 菌株10`ZS的形態(tài)學及生理生化反應特性。菌株10`ZS的革蘭氏染色和糖類分解、明膠液化及硝酸鹽還原等生理生化特性測定方法見參考文獻[9]。
1.2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。細菌的16S rDNA通用引物27F:5`-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3`(M=A+C)和1492R:5`-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3`(Y=C+T)[10],由華大基因公司合成。以CTAB法提取的菌株10`ZS的總DNA為模板進行PCR反應,20 μl反應體系組成為:10 ×Taq反應緩沖液2 μl,10 mmol/L的 dNTP 0.4 μl,5 μmol/L 的上、下游引物各 4 μl,3 U/μl的Taq DNA 聚合酶 0.2 μl,DNA 模板1 μl,ddH2O 8.4 μl。反應條件為:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,58℃退火45 s,72℃延伸90 s,循環(huán)30次,72℃延伸10 min。
擴增產(chǎn)物經(jīng)濃度1.0%瓊脂糖凝膠分離后,對擴增片段進行回收,將回收的目的片段與pMD18-T Simple載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性轉(zhuǎn)化子,進行菌落PCR鑒定,將陽性轉(zhuǎn)化子送華大基因公司對菌株10`ZS的16S rDNA進行測序分析。將測序結果在NCBI上進行BLAST分析,選取同源性較高的序列,利用Clustal X軟件進行多序列比對,用Phylip軟件的最大簡約法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.3 菌株生長特性的研究。將菌株10`ZS分別在25、30、35和40℃條件下培養(yǎng)12 h,測定菌液的OD600,研究溫度對菌株生長的影響。將菌株10`ZS在 pH 分別為5.0、6.0、7.0和8.0的條件下培養(yǎng)12 h,測定菌液的OD600,研究pH對菌株生長的影響。將菌株10`ZS分別接種到質(zhì)量分數(shù)為1%、2%、4%和6%NaCl的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12 h,測定菌液的OD600,研究NaCl溶液對菌株生長的影響。將菌株10`ZS分別接種到 Cu2+濃度為 0、0.2、0.4 和 0.6 mmol/L 的 LB 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12 h,測定菌液的OD600,研究Cu2+對菌株生長的影響。重復3次。
1.2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對染料脫色的研究。芽孢漆酶懸液的制備、漆酶活性的測定方法及芽孢漆酶對染料的脫色方法見參考文獻[11]?;钚粤了{(RBBR)、活性黑、靛紅和結晶紫分別屬于蒽醌、偶氮、靛藍和三苯甲烷類染料。
2.1 菌株10`ZS的形態(tài)學及生理生化反應特性 菌株10`ZS革蘭氏染色呈藍紫色,為革蘭氏陽性菌,桿狀,具有芽孢。菌株10`ZS能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇,具有明膠酶(表1)。
表1 菌株10`ZS的生理生化反應特性
2.2 菌株10`ZS的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 由圖1可知,菌株10`ZS的16S rDNA擴增條帶清晰,沒有非特異性擴增片斷,大小在1.5 kb左右,其測序結果為1 451 bp。將菌株10`ZS的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST同源性分析,它與芽孢桿菌屬同源性達99%。結合該菌株的形態(tài)和生理生化特性,將其命名為Bacillus sp.10`ZS。利用Clustal X軟件對菌株10`ZS、其他菌株的的16S rDNA進行多序列比對,用Phylip軟件的最大簡約法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。
圖1 菌株10`ZS的16S rDNA PCR結果
圖2 基于菌株10`ZS的16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.3 菌株10`ZS的生長特性 由圖3可知,菌株10`ZS的最適生長溫度是35℃,在25~40℃之間生長良好。由圖4可知,菌株10`ZS的最適生長pH為6.0,適宜在pH 5.0 ~8.0 生長。由圖5可知,菌株10`ZS在1% ~4%NaCl溶液中正常生長,在6%NaCl溶液中生長相對緩慢。由圖6可知,菌株10`ZS在0.2 ~0.4 mmol/L 的 Cu2+溶液中正常生長,在 0.6 mmol/L的Cu2+溶液中生長緩慢。
圖3 溫度對菌株10`ZS生長的影響
圖4 pH對菌株10`ZS生長的影響
2.4 菌株10`ZS的芽孢漆酶對染料的脫色效果 以丁香醛連氮為底物,以芽孢干重計算,菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7 U/g。由圖7可知,菌株10`ZS的芽孢漆酶對結晶紫、RBBR、靛紅和活性黑6 h脫色率分別為87.9%、78.5%、16.1%和 14.6%。
圖5 NaCl對菌株10`ZS生長的影響
圖6 Cu2+對菌株10`ZS生長的影響
圖7 菌株10`ZS芽孢漆酶對4種染料的脫色效果
菌株10`ZS是從東北林業(yè)大學實驗林場的樟子松林下的土壤中分離出來的,有芽孢,在pH 5.0~8.0的范圍內(nèi)均能生長,能夠耐受6%NaCl溶液。這些特性使得這株細菌適用于工業(yè)廢水的處理。菌株10`ZS能夠耐受0.6 mmol/L的Cu2+。這是它得以在Cu2+作為篩選劑的培養(yǎng)基中被分離出的原因。以丁香醛連氮為底物,以芽孢干重計,菌株10`ZS的芽孢漆酶活性為39.7U/g,稍低于Bacillussp.CLb[11]和Bacillus sp.9BS[12]的芽孢漆酶的活性。
菌株10`ZS的芽孢漆酶在6 h內(nèi)對三苯甲烷類染料結晶紫和蒽醌類染料RBBR的脫色率較高,分別為87.9%和78.5%。蒽醌類染料是漆酶的特異底物,可以直接被氧化[13],而三苯甲烷類染料不是漆酶的特異底物,但是菌株10`ZS的芽孢漆酶則可以直接氧化結晶紫使其脫色,表明菌株10`ZS的芽孢漆酶具有新的功能。綜上所述,菌株10`ZS具有耐鹽和耐銅的性能,在6 h內(nèi)芽孢漆酶對結晶紫和RBBR具有較高的脫色效果。這表明菌株10`ZS的芽孢漆酶在工業(yè)染料廢水的處理中具有潛力。
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