趙海儒， 吳淑芳*， 宋君龍， 丁少軍

（南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省制漿造紙科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210037）

內(nèi)切纖維素酶協(xié)助TEMPO氧化制備納米纖維1

趙海儒， 吳淑芳*， 宋君龍， 丁少軍

（南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省制漿造紙科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210037）

利用內(nèi)切型纖維素酶（EG1）預(yù)處理全漂硫酸鹽針葉漿，再經(jīng)過超聲波協(xié)助2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基（TEMPO，2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl radical）氧化制備納米纖維。通過氧化還原滴定和電導(dǎo)滴定監(jiān)測TEMPO氧化過程中殘余有效氯和纖維中的羧基含量的變化，并利用纖維粒度分析儀、毛細(xì)管粘度計和透射電鏡分析制備纖維樣品的尺寸分布、流動性能以及纖維形貌，研究了EG1預(yù)處理對超聲波協(xié)同TEMPO氧化制備納米纖維的影響。結(jié)果表明：相同的TEMPO氧化條件下，經(jīng)10 U/g EG1預(yù)處理12 h、24 h和48 h后，纖維羧基含量分別由2.05 mmol/g增加到2.35 mmol/g、3.03 mmol/g和3.13 mmol/g；與對照相比，經(jīng)EG1預(yù)處理再TEMPO氧化制備的樣品透明度增加，纖維尺寸減小，流動性下降。

內(nèi)切纖維素酶；納米纖維；TEMPO氧化；漂白針葉漿

超聲波協(xié)同2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基（TEMPO）催化氧化是一種制備納米纖維的有效方法之一[1]。在TEMPO催化氧化過程中，TEMPO能夠選擇性地將纖維表面的C6羥基氧化成羧基，羧基在堿性條件下呈現(xiàn)出負(fù)電荷，因靜電斥力作用，制備得到的納米纖維能夠相對穩(wěn)定地存在于水中；超聲波能夠打開纖維的層次結(jié)構(gòu)，從而使反應(yīng)速率增加。纖維素酶用于制備納米纖維的研究中，常與機(jī)械法或者化學(xué)法結(jié)合，用來彌補單純的機(jī)械法能耗較高，或者TEMPO氧化制備的納米纖維尺寸分布不均等缺陷[2-5]。

EG1是重組中性內(nèi)切型纖維素酶[6]，本文利用EG1預(yù)處理漂白針葉漿，而后以超聲波協(xié)同TEMPO氧化的方式制備納米纖維，探討EG1預(yù)處理對TEMPO氧化纖維中羧基含量、流動性能、粒徑分布以及形貌尺寸等性能的影響。

1 實驗

1.1材料與儀器

2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基購于百靈威公司公司，酵母汁和蛋白胨購于sigma公司，實驗所用其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

全漂硫酸鹽（KP）針葉漿，好聲牌，產(chǎn)自加拿大。漿板手工撕碎，浸泡過夜后疏解，離心脫水后撕成小碎片，放置在冰箱備用。菌種pPIC51-EG1-GS115，來自于南京林業(yè)大學(xué)微生物實驗室。

恒溫空氣浴搖床（DH2-2102型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司），探頭式超聲波（XO-650，南京先歐儀器制造有限公司），電導(dǎo)率儀（DDB-305，上海盛磁儀器有限公司），納米粒度分析儀（BT-90，丹東百特儀器有限公司），透射電鏡（JEM-1400，日本電子株式會社）。

1.2實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及試劑配制

YPD：將酵母汁、蛋白胨、山梨醇（終濃度分別為10 g/L、20 g/L、1 M）溶于蒸餾水，加入瓊脂（終濃度20 g/L），于121℃高溫高壓下滅菌20 min；冷卻至60℃時加入經(jīng)濾膜過濾滅菌的葡萄糖溶液（終濃度20 g/L）。

BMGY：10 g 酵母汁，20 g 蛋白胨溶于700 mL水，高溫高壓滅菌，冷卻到室溫后加入100 mL pH6.0的1M的磷酸鉀緩沖液（高溫高壓滅菌），100 mL 10倍的YNB（濾膜滅菌），2 mL 500倍B（20 mg 生物素溶于100 mL的水，濾膜滅菌），100 mL 10倍GY（100 mL甘油溶于900 mL水高溫高壓滅菌），混合均勻后4℃保存。

BMMY：10 g Yeast Extract，20 g peptone溶于700 mL水，高溫高壓滅菌，冷卻到室溫后加入100 mL pH 6的1 M的磷酸鉀緩沖液（高溫高壓滅菌），100 mL 10倍YNB（濾膜滅菌），2 mL 500倍B（20 mg biotin溶于100 mL的水，濾膜滅菌），100 mL 10倍M（5%的甲醇），混合均勻后4℃保存。

Somogyi 試劑：（A）溶液：Na2CO324 g、CuSO4·5H2O 4 g、NaHCO316 g、Na-K-Tartr（4H2O）12 g，溶于290 mL蒸餾水中；（B）溶液：Na2SO4180 g溶于500 mL蒸餾水，煮沸后冷卻。（A）加入（B）定容到1 L，2天后用Whatman濾紙過濾，37℃保存。

Nelson試劑：（C）溶液：(NH4)6Mo24· 4H2O 5 g溶于450 mL蒸餾水；（D）溶液：21 mL濃H2SO4與3 g溶于25 mL蒸餾水的Na2HAsO4· 7H2O混合。將（C）與（D）混合，定容至500 mL，37℃靜置2天后使用。

1.2.2 EG1培養(yǎng)

EG1的培養(yǎng)參見文獻(xiàn)[7]：將含有EG1的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)接至2 mL YPD培養(yǎng)基中，加2 μL Zeocin，30℃，275 r/min培養(yǎng)24 h。分別取6 mL上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至600 mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃，275 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到3～4，室溫下1 500 r/min離心10 min后重新加入200 mL BMMY培養(yǎng)基，30℃，275 r/min培養(yǎng)6天，每隔24 h加甲醇誘導(dǎo)，保持其濃度為0.5%（V/V）。培養(yǎng)完畢離心收集上清液測定酶活。

1.2.3 酶活測定

酶活測定采用Somogyi-Nelson法：1.5 mL 總反應(yīng)體系中含有0.9 mL 濃度0.1 mol/L（pH7.5）磷酸鈉緩沖液、0.5 mL 2%CMC-Na和0.1 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶液。50℃水浴反應(yīng)30 min，加入0.5 mL Somogyi試劑煮沸15 min，冷卻至室溫，加入0.5 mL Nelson試劑，靜置20 min，10 000 r/min離心10 min后，測定上清液于520 nm的吸光值。以煮沸滅活的相同濃度的酶液作為參比。定義每分鐘產(chǎn)生1 μmol 葡萄糖的酶量為1U，酶活單位為U/mL。

1.2.4 EG1預(yù)處理

150 mL三角瓶中加入1 g絕干纖維，10 mL 0.1 mol/L的磷酸氫二鈉―磷酸二氫鈉緩沖溶液（pH7.5）、90 mL去離子水和0.05%（相對絕干纖維）抗生素。將三角瓶固定在恒溫空氣浴搖床中，按設(shè)定的時間于50℃和160 r/min轉(zhuǎn)速下處理，至規(guī)定時間后80℃滅活10 min。自然冷卻后，置于4℃冰箱中備用。對照用緩沖液代替酶液，其它處理條件相同。

1.2.5 超聲波協(xié)同TEMPO氧化

將EG1預(yù)處理后的懸浮液轉(zhuǎn)移至250 mL燒杯中，加入0.16 g NaBr、0.016 g TEMPO和20 mmol NaClO，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10，室溫下反應(yīng)50 min后，用探頭式超聲波儀處理10 min，功率300 W。繼續(xù)TEMPO氧化50 min，超聲波處理10 min，依次循環(huán)，至反應(yīng)8 h后，加入0.1 mol/L硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。

1.3分析方法

1.3.1 反應(yīng)體系中有效氯含量的測定

利用碘當(dāng)量法測定反應(yīng)體系的有效氯含量[8]：測試體系中含有2 mL反應(yīng)懸浮液，10 mL 20%醋酸溶液和5 mL 100 g/L的KI溶液，用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液滴定。

1.3.2 羧基含量的測定

纖維中羧基含量測定采用電導(dǎo)滴定法（DDB-305電導(dǎo)率儀）[10]：0.200 0 g絕干氧化纖維素樣品分散于100 mL的0.001 mol/L NaCl溶液中，在氮氣保護(hù)和磁力攪拌下，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。

1.3.3 氧化纖維素尺寸分布分析

利用納米粒度分析儀測定纖維尺寸分布。TEMPO氧化結(jié)束后，取1～2滴樣品加入到樣品瓶中，用去離子水稀釋，調(diào)節(jié)樣品濃度，控制光子數(shù)在20～40范圍內(nèi)。利用對纖維投影測出氧化后纖維尺寸。

1.3.4 納米纖維流動性能分析

借鑒毛細(xì)管粘度計測定粘度的方法，在25℃恒溫下，檢測TEMPO氧化后纖維懸浮液（漿濃1%）流過毛細(xì)管粘度計所用的時間。

1.3.5 納米纖維尺寸測量

將氧化纖維素樣品滴在帶有碳膜的銅網(wǎng)上，風(fēng)干，滴上磷鎢酸溶液進(jìn)行染色。干燥后利用透射電鏡在加速電壓80 kV下進(jìn)行觀察。納米纖維尺寸的測量是通過手工測量納米纖維的TEM圖像進(jìn)行的。通過測量TEM圖像上納米纖維的長度、寬度，并且與TEM圖像自帶的標(biāo)尺進(jìn)行對比，得到納米纖維的長寬數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 EG1預(yù)處理對TEMPO氧化過程中氯耗及纖維素羧基含量的影響

關(guān)于超聲波協(xié)同TEMPO氧化制備納米纖維，錢赟做了大量的探索工作[1]。本研究借鑒其摸索出的TEMPO氧化條件，改變EGI預(yù)處理條件對漂白針葉漿進(jìn)行預(yù)處理，而后進(jìn)行超聲波協(xié)同TEMPO催化氧化制備納米纖維，研究酶處理條件對納米纖維素性能的影響。

圖1顯示的是EG1用量10 U/g，改變酶處理時間對TEMPO氧化過程中殘余有效氯和纖維羧基含量的影響。由圖1可以看出，無論對照還是經(jīng)EG1處理的樣品，TEMPO氧化過程中隨著時間的延長，反應(yīng)液中有效氯含量均呈下降趨勢。并且TEMPO氧化4 h前下降速度比較快，4 h后趨于平緩。相應(yīng)的，TEMPO氧化纖維上的羧基含量則隨著氧化時間延長呈上升趨勢，這與錢赟的研究結(jié)果基本一致。與對照相比，經(jīng)EG1處理后樣品TEMPO氧化過程中有效氯消耗量增加，相應(yīng)的氧化纖維素中羧基含量也高于對照樣品，并且EG1預(yù)處理時間越長，氧化后產(chǎn)品中的羧基含量越高。經(jīng)EG1預(yù)處理48 h的樣品，在本研究所采用的條件下氧化8 h，羧基含量由對照的2.05 mmol/g增加到3.13 mmol/g。EG1在預(yù)處理纖維的過程中隨機(jī)切斷纖維素長鏈，產(chǎn)生了更多的還原性末端和纖維碎片，暴露出更多的C6羥基，有利于后續(xù)超聲波協(xié)同作用下TEMPO催化氧化的進(jìn)行，因而，氧化產(chǎn)生的C6羧基也較多。

圖1 EG1處理時間對TEMPO氧化過程中殘余有效氯和纖維中羧基含量的影響

改變EG1用量預(yù)處理纖維48 h，同樣在超聲波協(xié)同TEMPO催化氧化過程中測定殘余有效氯和纖維樣品中羧基含量的變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 EG1用量對TEMPO氧化過程中殘余有效氯和纖維中羧基含量的影響

由圖2可以看出，隨著酶用量的增加，預(yù)處理后樣品在TEMPO氧化過程中殘余有效氯降低，即消耗的有效氯隨酶用量增加而增加，氧化后纖維中羧基含量也隨酶用量增加呈緩慢上升趨勢。TEMPO氧化4 h后羧基含量增加速度趨于緩慢，此時，酶用量從5 U/g增加到20 U/g，羧基含量則由2.01 mmol/g增加到2.31 mmol/g。

2.2纖維經(jīng)EG1預(yù)處理再超聲波協(xié)同TEMPO催化氧化后尺寸分布

圖3為超聲波協(xié)同TEMPO催化氧化8 h后，利用納米纖維粒徑分析儀測得的粒徑尺寸分布情況。由圖3可以看出，與對照樣品相比，經(jīng)EG1預(yù)處理再TEMPO氧化后的樣品，纖維粒徑均向小尺寸范圍移動。EG1預(yù)處理12 h、24 h和48 h，氧化后樣品粒徑大于1 000 nm的比例分別由對照的14%降低至12%、6%和5%。對照樣品400～600 nm尺寸范圍的比例最高，而經(jīng)過EG1預(yù)處理48 h后樣品尺寸主要集中在20～400 nm。

圖3 EG1預(yù)處理纖維TEMPO氧化8 h后樣品尺寸分布

2.3經(jīng)EG1預(yù)處理再超聲波協(xié)同TEMPO催化氧化后的分散液流動性及纖維形貌

圖4為對照及10 U/g用量下EG1預(yù)處理12 h、24 h和48 h后TEMPO氧化反應(yīng)8 h制備的樣品。由圖4可以看出，經(jīng)過TEMPO氧化后的納米纖維（濃度1%，pH 9～10）呈現(xiàn)出半透明膠狀，而EG1預(yù)處理可以提高產(chǎn)品透明度，并且預(yù)處理時間越長產(chǎn)品的透明度越高。相應(yīng)的，產(chǎn)品的粘度也隨著EG1預(yù)處理時間的延長而增大。

圖4 對照和EG1預(yù)處理樣品經(jīng)TEMPO氧化8 h后制備的納米纖維

借鑒毛細(xì)管粘度計測定粘度的方法，在25℃恒溫下，檢測TEMPO氧化后的纖維樣品流經(jīng)毛細(xì)管粘度計的時間，表征氧化后分散液的流動性能，結(jié)果如圖5所示。

圖5 EG1預(yù)處理對TEMPO氧化后的樣品流動性能的影響

由圖5可以看出，未經(jīng)EG1處理的纖維，超聲波協(xié)同TEMPO氧化后樣品流經(jīng)毛細(xì)管粘度計所用的時間隨著反應(yīng)時間的增加而增加，TEMPO氧化6 h、7 h和8 h后，流經(jīng)毛細(xì)管粘度計所用的時間分別為19.8 s、27.5 s和30.1 s。纖維經(jīng)EG1預(yù)處理12 h、24 h和48 h后再TEMPO氧化8 h，樣品流經(jīng)毛細(xì)管粘度計所用的時間分別比對照高了1.0%、8.0 % 和 9.6%；增加預(yù)處理時的酶用量也會增加氧化后產(chǎn)品的粘度，酶用量由10 U/g增加至20 U/g，則氧化后產(chǎn)品流經(jīng)毛細(xì)管粘度計的時間由32.5 s增加到34.0 s，增加了4.6%。粘度上升是由于增加預(yù)處理酶用量而導(dǎo)致后續(xù)氧化過程中解纖程度增加，即納米尺寸纖維數(shù)量增加所致。

利用透射電鏡觀察TEMPO氧化后樣品的形貌，測量纖維的長寬尺寸，結(jié)果如圖6和表1所示，A、B分別為對照和EG1用量10 U/g 預(yù)處理48 h后的樣品。EG1預(yù)處理后，纖維的長度和寬度尺寸均小于對照樣品。對照氧化纖維長度多為200～800 nm，預(yù)處理后降至150～600 nm；經(jīng)EG1預(yù)處理后氧化纖維素的寬度也由對照的10～30 nm 減小至10～25 nm，減少了約一個基原纖維寬度。

圖6 對照和EG1預(yù)處理48h的纖維經(jīng)TEMPO氧化后TEM圖像

表1 TEMPO氧化纖維素樣品的尺寸

3 結(jié)論

漂白針葉漿經(jīng)內(nèi)切纖維素酶EG1預(yù)處理后再利用超聲波協(xié)同TEMPO氧化制備納米纖維，與未經(jīng)EG1

處理的對照樣品相比，EG1預(yù)處理可增加纖維羧基含量，10 U/g EG1用量條件下預(yù)處理48 h，羧基含量增加約10%；經(jīng)EG1預(yù)處理再TEMPO氧化制備的納米纖維，其長度和寬度均小于對照樣品，均一度增加；經(jīng)EG1處理的TEMPO氧化纖維素的粘度也高于對照樣品。

[1] 錢赟. TEMPO氧化制備納米纖維的技術(shù)改良[D]. 南京林業(yè)大學(xué)碩士論文, 2013.

[2] P??kk? M, Ankerfors M, Kosonen K, et al. Enzymatic hydrolysis combined with mechanical shearing and high-pressure homogenization for nanoscale cellulose fibrils and strong gels[J]. Biomacromolecules, 2007, 8(6): 1934-1941.

[3] 李珊珊, 張洋, 王超, 等. 纖維素酶協(xié)同機(jī)械法制備微/納纖絲[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 19(11): 4-8.

[4] 李偉, 王銳, 劉守新. 納米纖維素的制備[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2010, 22(10): 2060-2070.

[5] Isogai A. Wood nanocelluloses: Fundamentals and applications as new bio-based nanomaterials[J]. J Wood Sci, 2013, 59: 449-459.

[6] 葉代勇. 納米纖維素的制備[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2007, 19(10): 1568-1575.

[7] Ding S, Ge W, Buswell J A. Secretion, purification and characterisation of a recombinant Volvariella volvacea endoglucanase expressed in the yeast Pichia pastoris[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2002, 31(5): 621-626.

[8] 石淑蘭, 何福望. 制漿造紙分析與檢測[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2010.

[9] Perez D, Montanari S, Vignon M R. TEMPO-mediated oxidation of cellulose Ⅲ[J]. Biomacromolecules, 2003, 4(5): 1417-1425.

[10] Saito T, Isogai A. TEMPO-mediated oxidation of native cellulose: The effect of oxidation conditions on chemical and crystal structures of the water-insoluble fractions[J]. Biomacromolecules, 2004, 5(5): 1983-1989.

Endo-glucanase Assisted Preparation of TEMPO Oxidized Cellulose Nanofibers

ZHAO Hai-ru, WU Shu-fang*, SONG Jun-long, DING Shao-jun

（Jiangsu Provincial Key Laboratory of Pulp and Paper Science and Technology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China）

Bleached softwood pulp was pretreated by EG1, then cellulose nanofiber (CNF) was prepared by a 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl radical (TEMPO) oxidation with ultrasonic. The residual active chlorine of cellulose/water slurry or dispersions and carboxyl group content of fiber could be monitored by redox and conductivity titration during TEMPO oxidation process. The particle size distribution, viscosity of dispersions and fiber morphology of nanofibers could be characterized by nanoparticle size analyzer, capillary viscometer and transmission electron microscopy (TEM) respectively. The results indicated that under the same conditions of TEMPO oxidation, carboxyl group content of cellulose was improved to 2.35 mmol/g, 3.03 mmol/g and 3.13 mmol/g from 2.05 mmol/g at 12 h, 24 h and 48 h respectively. Comparison with control sample, viscosity and transparency of nanofibers was increased, fiber size distribution was more uniform.

endo-glucanase; cellulose nanofiber; TEMPO oxidation; bleached softwood pulp

TS71.1

A

1004-8405(2015)04-0055-06

10.16561/j.cnki.xws.2015.04.13

2015-10-12

國家自然科學(xué)基金項目（31470593）。

趙海儒（1987~），男，碩士研究生；研究方向：制漿造紙工程。

* 通訊作者：吳淑芳（1968~），女，副教授，博士；研究方向：制漿化學(xué)及生物質(zhì)精煉。njwusf@163.com