戴銀，沈?qū)W懷，張丹俊，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031)

雞球蟲病(Chicken coccidiosis)是一種雞常見且危害嚴(yán)重的寄生蟲病，經(jīng)常由一種或多種球蟲聯(lián)合引起的急性流行性寄生蟲?。?－2］。不同種類的球蟲在雞腸道內(nèi)寄生部位有所差異，其致病力也有所不同，其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)寄生于盲腸，致病力最強(qiáng)［3］。10～30日齡的雛雞發(fā)病率最高，死亡率為20% ～30%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)80%［4］。感染的雛雞病愈后，生長(zhǎng)發(fā)育受阻，體重增加緩慢，嚴(yán)重影響肉雞飼料轉(zhuǎn)化率及蛋雞產(chǎn)蛋率。成年雞則一般不發(fā)病，但多為帶蟲者，增重和產(chǎn)蛋能力降低，是傳播球蟲病的重要病源之一。該病在全球發(fā)病普遍，我國(guó)每年也因該病造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，使用抗生素類和化學(xué)合成藥物是控制雞球蟲病的主要手段，這些藥物對(duì)雞球蟲病的防治起到重要作用，但由于大部分養(yǎng)殖人員沒有科學(xué)用藥，再加上我國(guó)對(duì)抗球蟲藥物使用的監(jiān)管力度不夠，長(zhǎng)期高劑量用藥現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致大量耐藥蟲株的出現(xiàn)，使得一些抗球蟲治效果降低甚至失效，因此對(duì)雞球蟲病防治工作越發(fā)困難［5－7］。筆者分離并培養(yǎng)較為常見且危害嚴(yán)重的雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，研究卵囊發(fā)育和感染的過程，以期為探索長(zhǎng)期有效的雞球蟲病防控方法打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 安徽省某家禽養(yǎng)殖場(chǎng)具有典型感染球蟲病雞的糞便。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑。飽和食鹽水、生理鹽水、2.5%重鉻酸鉀溶液。

1.2.2 儀器。燒杯、計(jì)數(shù)板、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、玻璃棒、60目銅篩、離心管、低速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、電子顯微鏡、烘箱。

1.3 球蟲卵囊的分離與培養(yǎng) 從安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所的養(yǎng)殖基地取感染球蟲病雞的糞便置于干凈的燒杯中，加入少量蒸餾水用玻璃棒搗碎混勻，再加入5倍體積的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?0目篩網(wǎng)過濾，重復(fù)水洗糞便2～3次，棄去殘?jiān)?。將濾液置于離心管中，4 00 0r/min離心6 min，棄去上清液。在沉淀中加入5倍體積的飽和食鹽水，攪拌混勻，裝入離心管中，4000 r/min離心6 min，取上清液置于干凈燒杯中，棄沉淀。用蒸餾水6倍稀釋上清，稀釋后置于離心管中，4 000 r/min離心6 min，棄上清液，重復(fù)水洗2次，洗去卵囊沉淀中的鹽分，加入2.5%的重鉻酸鉀溶液，置于培養(yǎng)皿中混勻，28℃條件下培養(yǎng)。

1.4 球蟲卵囊的觀察 將培養(yǎng)18、24、36、48 h后的球蟲卵囊置于顯微鏡下觀察并記錄其形態(tài)、顏色、大小和數(shù)量變化。當(dāng)有80%以上的卵囊發(fā)育為孢子化卵囊時(shí)停止培養(yǎng)，收集卵囊，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 球蟲卵囊的接種 將30只15日齡的健康肉雛雞隨機(jī)分成感染組和空白對(duì)照組，早晨空腹逐只稱重，記錄并計(jì)算初始平均體重，各組試驗(yàn)雞在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，空白對(duì)照組進(jìn)行單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，以防污染。感染處理組每只雞接種約1×105個(gè)卵囊，接種后每天觀察并記錄各組雞的臨床表現(xiàn)(如采食、飲水、行為、羽毛的光澤度、精神狀態(tài)，血便和發(fā)病死亡情況等)，試驗(yàn)結(jié)束后解剖發(fā)病雞，記錄發(fā)病部位和發(fā)病程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵囊的形態(tài)變化 混勻培養(yǎng)溶液，用移液槍吸取少量的液體滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在電鏡下觀察。從圖1可以看出，分離到的球蟲卵囊大多形態(tài)飽滿，為寬橢圓形，少數(shù)為卵圓形，壁光滑，中間明顯可見1個(gè)圓形的核，原生質(zhì)呈淡褐色，卵囊大小約為18.5 ～25.5 μm ×16.7 ～22.5 μm。正常的孢子化卵囊多能見到分化明顯的4個(gè)形狀規(guī)則的孢子，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)18 h即可看到部分卵囊孢子化，約占總數(shù)的13%;24、36、48 h分別有33%、80%和95%的卵囊孢子化。

2.2 接種雞的臨床表現(xiàn) 接種后每天觀察并記錄2組雞的臨床表現(xiàn)，感染組第3天有個(gè)別雞狀態(tài)不佳，第4天感染組部分雛雞不同程度表現(xiàn)出采食量減少、食欲不佳、精神萎靡沉郁、羽毛蓬亂、翅膀下垂等臨床癥狀，嚴(yán)重則出現(xiàn)離群呆立，縮頸閉眼，甚至食欲廢絕等癥狀，繼而出現(xiàn)拉稀或者血便等現(xiàn)象。第5天陸續(xù)出現(xiàn)6例因感染球蟲而致死的死亡病例。然而，健康對(duì)照組雛雞則精神、食欲、飲欲和糞便均表現(xiàn)正常。

2.3 血便、死亡和體重變化 未接種卵囊的雛雞整個(gè)試驗(yàn)過程中均較健康，未出現(xiàn)血便和死亡現(xiàn)象。接種卵囊的雛雞第4天開始出現(xiàn)血便，占全部糞便的50%，第6天出現(xiàn)大量血便，占達(dá)80%左右，第7天血便量則有所下降(表1)。由表2可知，接種雛雞第5天死亡2只，第6天死亡3只，第7和8天則各死亡1只，到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活率僅為53.3%。未接種和接種雛雞試驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均凈增重差異明顯，分別為76.7和9.3g，接種雞相對(duì)增重僅為12.1%(表3)。此外，試驗(yàn)第8天逐只解剖接種雞，發(fā)現(xiàn)病雞盲腸壁增厚，病變明顯，嚴(yán)重者盲腸腫大，充滿大量血液。

表1 雛雞的血便情況

表2 雛雞的死亡情況

表3 雛雞體重的變化

3 討論

近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，球蟲病的危害日趨嚴(yán)重。雞球蟲分布廣、危害性大，種類較多，世界各國(guó)已經(jīng)記載的約有14種，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的至少7種［8－9］。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法是球蟲種類鑒定常用的方法，該方法準(zhǔn)確性高，可應(yīng)用于雞球蟲的鑒定［10］。雞球蟲不同種類寄生部位和致病性均有差異，其中柔嫩艾美耳球蟲致病性最強(qiáng)，是危害最嚴(yán)重的一個(gè)種。柔嫩艾美耳球蟲寄生于盲腸，臨床上出現(xiàn)明顯的血便，這種特征有助于純種的分離鑒定。該研究分離的雞球蟲球蟲卵囊形態(tài)飽滿，多為寬橢圓形，卵囊大小約為18.5～25.5 μm ×16.7 ～22.5 μm，孢子化卵囊多能見到分化明顯的4個(gè)形狀規(guī)則的孢子;此外，接種的發(fā)病雛雞，體重增加緩慢，血便明顯，死亡率較高，同時(shí)解剖可見盲腸明顯病變，且腸壁增厚，嚴(yán)重者因充滿大量血液而盲腸腫大。根據(jù)卵囊的形態(tài)、大小，發(fā)病雞的臨床特征，卵囊寄生部位和盲腸病理變化等特征，以及已有文獻(xiàn)的報(bào)道［9，11－12］，初步判斷該試驗(yàn)分離到的球蟲主要為柔嫩艾美耳球蟲。目前，控制球蟲病的手段主要還是抗球蟲藥物，由于抗生素和化學(xué)藥物的長(zhǎng)期不規(guī)范使用導(dǎo)致球蟲產(chǎn)生了耐藥性，藥物使用年限不斷縮短，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。筆者對(duì)安徽地區(qū)的雞球蟲進(jìn)行了初步分離和感染試驗(yàn)，為進(jìn)一步深入研究雞球蟲的致病和抗藥機(jī)制及雞球蟲病預(yù)防控制奠定基礎(chǔ)。

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