姚嘉赟，袁雪梅，徐洋，藺凌云，尹文林，潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州313001)

小瓜蟲(Ichthyophthirius multifilis)，隸屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬［1］。該纖毛蟲體被分散排布且長(zhǎng)短均一的纖毛，其生活史分為滋養(yǎng)體(Trophont)、包囊體(Tomont)和幼蟲(Theronts)3個(gè)階段。滋養(yǎng)體主要寄生在宿主體表，在病灶處呈邊緣明顯的白點(diǎn)，因此該寄生蟲病也稱“白點(diǎn)”病。當(dāng)滋養(yǎng)體發(fā)育成熟并離開魚體后，經(jīng)過一段時(shí)間的游泳后沉到水底，分泌一層透明而有彈性物質(zhì)將自身包裹形成包囊，經(jīng)有絲分裂形成幾百上千的幼蟲，幼蟲出包囊后又去感染其他的魚體［2］。小瓜蟲的生活史中不需要中間寄主，其繁殖迅速，同時(shí)又是活體寄生，在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)常常爆發(fā)流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］，最嚴(yán)重時(shí)曾造成年均20～30萬t魚死亡，年均損失達(dá)20～30億元。因此，小瓜蟲的防治研究一直都是水產(chǎn)學(xué)科研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

為了找到有效防治小瓜蟲病的方法，研究者開展了大量探索?？兹甘G和硝酸亞汞被認(rèn)為是較為有效的物質(zhì)，但是因其具有致癌作用目前已被禁用［4］。此后，甲醛［5］、硫酸銅［6］、過氧化氫［7］和高鐵酸鉀［8］等被用于控制小瓜蟲病，雖然有一定的功效，但是長(zhǎng)期使用帶來的是環(huán)境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為目前食品安全和水產(chǎn)品出口的綠色貿(mào)易壁壘問題，引起社會(huì)各界普遍關(guān)注。因此，尋找對(duì)小瓜蟲病的治療行之有效、環(huán)境友好型藥物是一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。筆者也利用提取分離技術(shù)從天然植物博落回和小果博落回中分離到3種化合物血根堿［9］，二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿［10］對(duì)小瓜蟲具有較強(qiáng)的殺滅作用。

微生物資源作為自然資源的一大寶庫(kù)，蘊(yùn)藏著巨大的潛力，因其具有特殊的遺傳背景和代謝途徑，能夠產(chǎn)生各種具有特殊功能的酶類及結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣性的活性物質(zhì)，因此在有效創(chuàng)制醫(yī)藥、獸藥和農(nóng)藥等新藥及探索具有生物活性的先導(dǎo)化合物等方面越來越受到重視和青睞。鏈霉菌是放線菌目的一科，而目前約75%的商用、藥用抗生素以及約60%的農(nóng)用抗生素均是由它們產(chǎn)生［11］。在前期研究中從各地分離到近100種鏈霉菌，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌XY－52的發(fā)酵液具有較強(qiáng)的殺蟲作用。基于此，筆者利用溶劑提取法對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行殺蟲活性部位的研究，旨在為進(jìn)一步殺蟲活性成分的提取分離奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為新型殺蟲藥物的創(chuàng)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚 嚴(yán)重感染小瓜蟲的草魚(體質(zhì)量(67.8±5.6)g)來自湖州市東林某養(yǎng)殖場(chǎng)。隨機(jī)選取10尾魚，取全鰓鏡檢觀察統(tǒng)計(jì)鰓上小瓜蟲數(shù)量，試驗(yàn)魚小瓜蟲感染率為100%，每尾魚平均感染小瓜蟲約110個(gè)。健康草魚(體質(zhì)重(34.2±3.7)g)來自浙江省淡水水產(chǎn)研究所苗種基地。

1.2 鏈霉菌發(fā)酵液提取物的制備

1.2.1 鏈霉菌。鏈霉菌(Streptomyces sp)XY-52分離自湖州太湖底泥，經(jīng)鑒定為鏈霉菌。

1.2.2 發(fā)酵液提取物不同溶劑萃取物的制備。鏈霉菌經(jīng)高氏1號(hào)于30℃條件下培養(yǎng)5 d后，3 000 r/min離心15 min，取沉淀經(jīng)真空冷凍干燥于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取干燥后的沉淀物溶解于一定量的水中，制成懸浮液，按照溶劑極性由小到大的順序依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，制備成石油醚提取物(Pe-E)、乙酸乙酯提取物(Eto-E)、正丁醇提取物(Nbu-E)、殘留水提取物(Ra-E)。

1.3 體外殺蟲試驗(yàn)

1.3.1 蟲體的收集。將嚴(yán)重感染小瓜蟲的草魚放入燒杯中，待小瓜蟲游出后，用吸管將成熟小瓜蟲收集放入平皿中，一部分蟲體用于小瓜蟲幼蟲的培養(yǎng)，一部分用于包囊的收集［10］。

1.3.2 不同極性提取物對(duì)幼蟲的體外殺滅試驗(yàn)。試驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，于每個(gè)細(xì)胞孔中加入約2 ml不同濃度的藥液和約100個(gè)小瓜蟲幼蟲，于用藥后15 min、1 h、2 h、3 h、4 h鏡檢觀察1次，4 h后統(tǒng)計(jì)各孔的小瓜蟲死亡率。試驗(yàn)設(shè)置DMSO對(duì)照組和充分暴氣自然水對(duì)照組，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。小瓜蟲死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn):蟲體纖毛不運(yùn)動(dòng)，胞質(zhì)不流動(dòng)，胞膜破裂，細(xì)胞核破碎。

1.3.3 不同極性提取物對(duì)包囊的體外殺滅試驗(yàn)。試驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，于每個(gè)細(xì)胞孔中加入約2 ml不同濃度的藥液和30個(gè)小瓜蟲包囊，于用藥后6 h后，小心吸出藥液，然后加入經(jīng)紗布過濾的地下水，再放置于22℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20～36 h，直至對(duì)照組的包囊孵化出幼蟲后試驗(yàn)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)各孔的小瓜蟲包囊死亡率，同時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)細(xì)胞孔中的幼蟲的含量。試驗(yàn)設(shè)置DMSO對(duì)照組和地下水組，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。小瓜蟲包囊死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:包囊未分裂或包囊未孵出幼蟲。

1.4 正丁醇提取物對(duì)草魚的急性毒性試驗(yàn) 因?yàn)檎〈继崛∥飳?duì)小瓜蟲的體外殺蟲效果最強(qiáng)，故而有必要研究其對(duì)草魚的安全性。按照姚［10］等方法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)在階梯式全控溫循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，試驗(yàn)前草魚在水泥池進(jìn)行適應(yīng)性養(yǎng)殖7 d以上，自然死亡率小于0.5%后進(jìn)行毒性預(yù)試驗(yàn)，確定藥物24 h全部致死的最高濃度和96 h全部存活最低濃度，并按等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)7個(gè)濃度:289.0、256.0、225.0、196.0、156.0、144.0 和 121.0 mg/L。試驗(yàn)條件如下:控溫設(shè)備控制水溫(25±1)℃，pH7.0～7.5。按隨機(jī)原則、對(duì)照原則和重復(fù)原則進(jìn)行藥物毒性試驗(yàn)，每組10尾草魚，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，并記錄12、24、48和96 h各組草魚的狀況及存活率。

根據(jù)平均死亡率，利用直線內(nèi)插法計(jì)算出半致死濃度(LC50):安全濃度 =(24 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)3。

1.5 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 16.0處理藥效數(shù)據(jù)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液各溶劑提取物對(duì)小瓜蟲的殺滅活性研究 從圖1可以看出，在20.0～100.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，石油醚提取物和水殘留提取物對(duì)小瓜蟲幼蟲的殺滅率均小于50%;60.0 mg/L的乙酸乙酯提取物對(duì)幼蟲的殺滅率為90%，其對(duì)幼蟲的半數(shù)致死濃度為48.2 mg/L，對(duì)幼蟲殺滅效果最好的是正丁醇提取物，30.0 mg/L的正丁醇提取物對(duì)幼蟲的殺滅率為100%，其對(duì)幼蟲的半數(shù)致死濃度為15.5 mg/L，DMSO對(duì)照組對(duì)幼蟲的殺滅率為0。各提取物對(duì)幼蟲的殺蟲活性的順序則依次是正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水殘留提取物＞石油醚提取物。

由表1可知，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水殘留提取物對(duì)小瓜蟲包囊均具有一定的殺滅作用，但是正丁醇提取物的殺滅效果最強(qiáng)，其濃度為30.0 mg/L時(shí)對(duì)包囊的殺滅率為100%。其次為乙酸乙酯提取物，其濃度為60.0 mg/L時(shí)對(duì)包囊的殺滅率為85.6%，DMSO對(duì)照組對(duì)包囊分裂和孵化沒有影響。同時(shí)，正丁醇和乙酸乙酯提取物對(duì)包囊的孵化率也明顯的高于石油醚組和水殘留組。

表1 鏈霉菌發(fā)酵液4種提取物對(duì)小瓜蟲包囊及其孵化率的作用

2.2 正丁醇提取物對(duì)草魚的急性毒性試驗(yàn) 由表2可知，正丁醇提取物對(duì)草魚的24 h的半致死濃度為(LC50)為213.7 mg/L;48 h的半致死濃度為(LC50)為195.0 mg/L;96 h的半致死濃度為(LC50)為181.5 mg/L;根據(jù)公式計(jì)算可得，其安全濃度為48.7 mg/L。

表2 正丁醇提取物對(duì)草魚的急性毒性

3 討論

微生物代謝產(chǎn)物因其具有結(jié)構(gòu)新穎性和多樣性，在科學(xué)研究和應(yīng)用開發(fā)中具有重要價(jià)值，逐漸受到人們的廣泛關(guān)注，也已稱為國(guó)際微生物學(xué)的熱點(diǎn)之一，其在抗菌［12］、殺蟲［13］、抗真菌［14］等各領(lǐng)域得到廣泛的認(rèn)可并展現(xiàn)出巨大的潛力。然而，目前在水產(chǎn)動(dòng)物殺蟲藥物研究開發(fā)領(lǐng)域還極少，因此該研究對(duì)鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小瓜蟲殺滅的活性部位進(jìn)行研究。微生物發(fā)酵產(chǎn)物成分十分復(fù)雜，因此僅用某一種溶劑不可能將其所有的組成成分都提取出來，所以有必要采用極性由弱到強(qiáng)的幾種不同溶劑進(jìn)行提取，使各成分依其在不同極性溶劑中的溶解度差異而分離出來，從而避免最強(qiáng)活性物質(zhì)的“漏篩”［15］。該研究通過石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和水5種溶劑對(duì)鏈霉菌XY－52進(jìn)行系統(tǒng)提取，并發(fā)現(xiàn)其殺蟲活性部位主要在于其正丁醇部位。

鏈霉菌是一種革蘭氏陽性絲狀放線菌，可產(chǎn)生多種類型的具有重要價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物，也被人們稱為天然藥物的合成工廠。目前，世界上大部分抗生素和生物聚合物均由其產(chǎn)生，其產(chǎn)生的抗生素主要包括氨基糖苷類、糖肽類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類等等［16］。該研究通過離體試驗(yàn)確定了鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的主要?dú)⑾x活性部位，但是發(fā)酵液提取物一般為混合物，若要確定其功效成分，還必須通過活性追蹤方法對(duì)該活性部位進(jìn)行提取分離，并通過對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系進(jìn)行分析才能最終確定殺蟲的活性物質(zhì)，因而其殺蟲活性物質(zhì)的分離鑒定有待于進(jìn)一步研究。

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