馬 欣，喬俊卿(.運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機(jī)食品工程系，山西運(yùn)城044000;.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京004)

植物土傳病害是指由生活在土壤中的病原體從作物根部或莖部侵害作物而引起的病害［1］，其病原菌一般為多寄主微生物，具有很強(qiáng)的生活能力和侵染能力，在惡劣的環(huán)境下具有特殊的生存方式，防治極為困難［2］。目前，我國保護(hù)地蔬菜的種植面積不斷增加，種植方式逐步趨于規(guī)模化和專業(yè)化，形成了很多黃瓜、番茄、辣椒等蔬菜種植基地，已成為農(nóng)民增收致富的主要渠道［3］。然而，部分地區(qū)由于作物種植結(jié)構(gòu)的原因?qū)е略O(shè)施蔬菜生產(chǎn)高度集約化、復(fù)種指數(shù)高、蔬菜品種單一［2］、蔬菜生產(chǎn)長期連作、高密度栽培，另外，由于灌溉方法和糞肥使用不當(dāng)［3］等，為土傳病害病原菌提供了賴以生存的寄主和繁殖場所［2］，從而導(dǎo)致土壤中病原菌大量積累，土傳病害發(fā)生日益嚴(yán)重。其中，番茄枯萎病和辣椒根腐病就是2種典型的土傳病害，發(fā)病嚴(yán)重時減產(chǎn)高達(dá)50%，甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響了設(shè)施番茄和設(shè)施辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失，已成為番茄和辣椒栽培中的重點(diǎn)防治對象。

目前生產(chǎn)上多采用抗病品種、作物輪作、化學(xué)藥劑、生物防治等方法防治蔬菜土傳病害［4］。其中，化學(xué)藥劑防治殺菌譜廣、效率高、見效快，但病原菌極易對其產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥施用量不斷增加，在殺滅病原菌的同時也造成有益微生物死亡，破壞了土壤中的原有的微生物平衡，造成農(nóng)藥殘留量增大、環(huán)境污染加劇，威脅人類健康和安全［5］。隨著人們的環(huán)保和健康意識逐漸增強(qiáng)，對果蔬病害治理后的農(nóng)藥殘留、營養(yǎng)價值等問題越來越關(guān)注，使化學(xué)藥劑的使用受到一定的限制［2］。生物防治方法是一種環(huán)境友好的防治措施，但生防微生物容易受到土壤類型、質(zhì)地、溫度、濕度、pH等理化性質(zhì)以及氣溫、光照、降雨量及土壤中微生物種群等環(huán)境因素的影響，生防效果不穩(wěn)定［5］。因此，尋找高效、低毒、穩(wěn)定的新型藥劑和防治方法成為今后防治蔬菜土傳病害的重要目標(biāo)。

植物是生物活性化合物的天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過40萬種，目前人們已經(jīng)從植物、微生物中提取到多類抗真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲、殺蟲、除草的活性物質(zhì)，從植物中探尋新的活性先導(dǎo)化合物或新的農(nóng)藥靶標(biāo)，通過類推合成或生物合理設(shè)計新利用的開發(fā)已成為當(dāng)今農(nóng)藥化學(xué)和農(nóng)藥毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)［6］。然而，目前植物源農(nóng)藥的研究主要集中在殺蟲活性方面，具有抑菌活性的植物提取物的研究相對較少，而利用中草藥植物防治番茄枯萎病和辣椒根腐病等蔬菜土傳病害的研究報道更少［7］。為此，筆者以番茄枯萎病和辣椒根腐病為防治對象，對8種中草藥植物不同部位提取液的抑菌活性進(jìn)行了初步篩選，旨在為進(jìn)一步開發(fā)和研制防治蔬菜土傳病害的新型植物源殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥材。試驗用中草藥共8種，隸屬于8個科，均購于山西省運(yùn)城市中藥市場。供試中草藥種類及使用部位見表1。

1.1.2 供試植物病原菌。番茄枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici Snyder et Hansen)為實(shí)驗室保存;辣椒根腐病病原菌(Fusarium vasinfectum)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈。供試菌種均由馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基28℃下繼代培養(yǎng)，并放置在4℃冰箱保存，備用。

表1 供試中草藥

1.2 方法

1.2.1 中草藥提取液的制備。采用超聲波提取法。將陰干的植物材料在45℃恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱中吹干至發(fā)脆，用植物粉碎機(jī)粉碎，過80目篩后備用。稱取各植物樣品干粉100 g，用70%乙醇按1∶6的料液比浸泡，攪拌使溶劑完全浸沒中草藥材料，置于避光處靜置24 h后，在45℃、80 Hz的條件下超聲輔助提取30 min，減壓抽濾得濾液，殘渣再次采取相同方法進(jìn)行處理，重復(fù)提取3次，合并3次濾液。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃條件下減壓濃縮至無溶劑蒸出(呈浸膏狀)，稱重，計算提取率，并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。然后?0%乙醇定容至2 g/ml，密封編號后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

提取率=(濃縮后容器與提取物的總重－容器本身的重量)/樣品的重量×100%

1.2.2 中草藥提取物抑菌活性的離體測定。采用生長速率法。將PDA培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至45～50℃，取供試藥液1.5 ml于培養(yǎng)基中混合均勻制成濃度為30 mg/ml的帶藥培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用內(nèi)徑6 mm的打孔器在菌落邊緣生長旺盛區(qū)域打取菌餅，然后用接種針挑至培養(yǎng)皿中心處，每皿1個菌餅，每處理3次重復(fù)。以混有70%乙醇的PDA和純PDA培養(yǎng)基作為對照。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)對照組菌落生長至充滿培養(yǎng)皿約80%時，采用十字交叉法測量供試病菌的菌落直徑，計算生長抑制率。

菌落直徑(mm)=測量菌落直徑平均值－4.0

抑菌率(%)=(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.2.3 統(tǒng)計分析。利用DPS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性方差分析(Duncan’s新復(fù)極差法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥乙醇提取物的提取率 由圖1可知，8種中草藥的乙醇提取物中，連翹的提取率最高，為85%，其次是黃芪提取物，提取率為80%，提取率較低的是金錢草和柴胡提取物，提取率均為10%，其余4種中草藥乙醇提取物的提取率均超過10%。上述結(jié)果表明，超聲波法提取效率較高，8種中草藥乙醇提取物的提取效率均在10%以上;另外，不同種中草藥的同種溶劑提取物的提取率有所不同。

2.2 中草藥提取物對番茄枯萎病病原菌的抑制作用 在中草藥提取物抑菌活性的離體測定中，8種中草藥提取物均對番茄枯萎病病原菌表現(xiàn)出抑制作用，并且在藥液濃度為30 mg/ml時，不同中草藥的抑菌效果不同，且存在顯著差異，黃柏對番茄枯萎病病原菌的抑菌率最高，為90.77%，其次是黃芪，抑菌率為67.10%，對番茄枯萎病病原菌抑制率最弱的是連翹，抑菌率為11.49%，有3種中草藥的乙醇提取物對番茄枯萎病病原菌的抑菌率在60%以上，分別是黃柏、黃芪和馬齒莧(表2)。因此，選取抑菌效果較好的黃柏等3種中草藥，分別稀釋成不同濃度梯度測定抑菌效果，結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，3種中草藥的抑菌活性隨著藥液濃度的降低而減弱，并且呈現(xiàn)顯著差異(表3)。在藥液濃度為30 mg/ml時，黃柏對番茄枯萎病病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)90%以上。

表2 8種中草藥對番茄枯萎病和辣椒根腐病病原菌的抑菌率 %

2.3 中草藥提取物對辣椒根腐病病原菌的抑制作用 在中草藥提取物抑菌活性的離體測定中，8種中草藥提取物均對辣椒根腐病病原菌表現(xiàn)出抑制作用，并且在藥液濃度為30 mg/ml時，不同中草藥的抑菌效果存在顯著差異，其中，黃柏對辣椒根腐病病原菌的抑菌率最高，為66.09%，其次是馬齒莧，抑菌率為59.66%，對辣椒根腐病病原菌抑制率最弱的是連翹，抑菌率為6.41%，有4種中草藥的乙醇提取物對辣椒根腐病病原菌的抑制率在50%以上，分別是黃柏、馬齒莧、金錢草和穿心蓮(表2)。因此，選取抑菌效果較好的黃柏、馬齒莧和金錢草3種中草藥，分別稀釋成不同濃度梯度測定抑菌效果，結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，3種中草藥的抑菌活性隨著藥液濃度的降低而減弱，并且呈現(xiàn)顯著差異(表3)。上述結(jié)果表明，在藥液濃度為30 mg/ml時，黃柏對辣椒根腐病病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)60%以上。

3 討論

試驗采用超聲波法、乙醇對8種不同中草藥植物的化學(xué)成分進(jìn)行提取，并以番茄和辣椒栽培中發(fā)生危害較嚴(yán)重的2種土傳病害病原菌為供試菌對8種中草藥乙醇提取物的抑菌活性進(jìn)行了離體測定。研究發(fā)現(xiàn)，8種中草藥提取物對番茄枯萎病和辣椒根腐病病原菌都表現(xiàn)出了不同程度的抑菌作用，黃柏、黃芪和馬齒莧的乙醇提取物對番茄枯萎病病原菌的抑菌率達(dá)60%以上，黃柏、馬齒莧、金錢草和穿心蓮的乙醇提取物對辣椒根腐病病原菌的抑菌率達(dá)50%以上，其中，以黃柏的抑菌效果最好，對番茄枯萎病病原菌的抑制作用高達(dá)90%以上，且在一定范圍內(nèi)，抑菌活性隨著藥液濃度的升高而增強(qiáng)。目前，對黃柏的研究僅局限在對人致病病原菌的抑制作用［8］，有研究證明黃柏的粗提物中含有黃酮醇苷，黃酮醇苷對金黃色葡萄球菌等人類病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用［9］，而黃柏對蔬菜土傳病害病原菌的抑制作用方面的研究極度缺乏，今后，可對黃柏提取物的抑菌活性成分、田間使用效果及穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為開發(fā)新型植物源殺菌劑、防治蔬菜土傳病害奠定基礎(chǔ)。

［1］李麗霞，夏明聰，孔景萍.拮抗菌對土傳病害防治效果的初步研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(2):54－55.

［2］曲春鶴.辣椒根腐病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及其作用效果的初步研究［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［3］武澤民，于振茹，盧立華，等.設(shè)施蔬菜土傳病害的診斷與綜合防控措施［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(31):12320 －12321，12323.

［4］李清飛，趙承美，余國忠，等.蔬菜土傳病害生態(tài)防控技術(shù)研究［J］.北方園藝，2011(14):192－194.

［5］曲春鶴，何付麗，劉培福，等.辣椒根腐病拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及其抑菌促生作用［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43(7):89 －94.

［6］王進(jìn)忠，李海玉，王大鵬，等.4種中草藥提取物對常見果樹病原菌的抑制作用［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2004，19(2):35 －38.

［7］郭慶港.防治黃瓜霜霉病植物提取物的篩選與研究［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［8］陳蕾，邸大琳.黃柏體外抑菌作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(5):759－760.

［9］郭志堅，郭書好，何康明，等.黃柏葉中黃酮醇甙含量測定及其抑菌實(shí)驗［J］.暨南大學(xué)學(xué)報，2002，23(5):64－66.