慎鏞健，徐 昌，李 穎，李秀媛(.大慶市環(huán)境監(jiān)測中心站，黑龍江大慶6336;.大慶市輻射環(huán)境監(jiān)督站，黑龍江大慶6336)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅離子的多酚氧化酶，自1883年日本學者 Yoshida首次發(fā)現(xiàn)漆酶以來［1－3］，漆酶一直是化學、生物學以及環(huán)境科學研究的熱點問題［4］。目前，已發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛分布于自然界，己在高等植物、真菌、昆蟲以及細菌體內發(fā)現(xiàn)，很多漆酶來自植物和真菌以及少量的細菌［5－8］?？莶菅挎邨U菌是一種研究較多的細菌，其熱穩(wěn)定性較好，但是關于其報道較少［9－11］。筆者從大慶林甸海達紙業(yè)公司造紙廠活性污泥中分離得到了一株活性漆酶細菌菌株WG35，結合形態(tài)學觀察、生理生化特性研究以及16S rDNA序列分析對其進行鑒定，并將該菌株應用于造紙廢水的處理。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑 試驗樣品來自大慶林甸海達紙業(yè)公司造紙廠活性污泥。主要試劑包括丁香醛連氮(Sigma公司)、質粒提取試劑盒(Omega公司)、膠回收試劑盒(Omega公司)、rTaq酶(TaKaRa公司)、pMD18-T 載體(TaKaRa公司)、Escherichia coli JM109感受態(tài)細胞(TaKaRa公司)，其余試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 產漆酶菌種篩選。在無菌條件下，將20 g活性污泥樣品加入到滅菌的液體LB培養(yǎng)基內。在37℃下振蕩培養(yǎng)36 h后，進行梯度稀釋。然后，在LB固體平板后涂布，37℃培養(yǎng)6 d后，取含有單菌落平板，菌落周圍滴加丁香醛連氮，純化菌種。

1.2.2 菌株鑒定。

1.2.2.1 菌株形態(tài)學鑒定。菌株進行培養(yǎng)后，按照文獻［10］中的方法進行形態(tài)學鑒定:①觀察菌體、菌落特征;②依次進行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色等試驗。

1.2.2.2 菌株的生理生化鑒定。對篩選到的菌株，根據(jù)16S rRNA序列同源性分析與細菌系統(tǒng)分類鑒定中的方法進行生理生化鑒定，包括氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、甲基紅(M.R)試驗、V.P試驗、糖或醇類發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗、產生吲哚試驗、硫化氫試驗、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用試驗、丙二酸鹽利用試驗、酪氨酸水解試驗、馬尿酸鹽水解試驗、對疊氮化鈉抗性試驗、對溶菌酶抗性試驗、好氧性試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗，并根據(jù)試驗結果對照《伯杰細菌鑒定手冊》。

1.2.2.3 菌株的16S rDNA鑒定。菌株的16S rDNA鑒定包括基因組DNA的提取、16S rDNA序列的擴增(采用基因組DNA為模板，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測)、PCR擴增產物的純化與連接、連接產物的轉化與驗證、16S rDNA測序與序列分析。

1.2.3 漆酶對造紙黑液的處理研究。造紙黑液取自大慶海達紙業(yè)有限公司。取造紙黑液100 ml，以丁香醛(syringaldehyde，SYR)作為降解體系介體。調節(jié)介體濃度為0.1 mmol/L，在40℃、pH=8.0條件下，往造紙黑液中加入篩選菌株所產漆酶的粗提液2%，并作用3 d。用COD和BOD儀分別測定經漆酶處理第2天和第3天造紙黑液中BOD/COD比值，考察生化可降解率變化情況。

2 結果與分析

2.1 產漆酶細菌的篩選與鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)學鑒定。將樣品通過含Cu2+培養(yǎng)基富集后，利用在菌落中央及邊緣滴加漆酶底物SGZ再從污泥中分離的細菌中篩選出一株可在氧化丁香醛連氮變紅的細菌，將其編號為WG35。WG35菌株革蘭氏染色呈陽性，有莢膜及鞭毛，菌落不透明。由圖1和圖2可知，菌體大小約為0.4～0.6 μm ×1.0 ～2.5 μm，芽孢呈橢圓形，大小約為0.8 μm ×1～2 μm。

2.1.2 菌株的生理生化鑒定。由表1可知，菌株WG35的氧化酶反應、過氧化氫酶反應陽性;V.P反應陽性;好氧性試驗結果呈陽性;硝酸鹽還原反應陽性;能夠分解淀粉、酪氨酸;能夠液化明膠;能夠利用果糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、檸檬酸鹽;M.R反應陰性;不能利用丙二酸鹽、丙酸鹽、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖;不能水解馬尿酸鹽;不能在0.02%疊氮化鈉內生長;0.001%溶菌酶能生長。通過生理生化特征和形態(tài)學鑒定，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌。

表1 菌株WG35的部分生理生化特征

2.1.3 菌株的16S rDNA鑒定。圖3為菌株WG35基因組DNA電泳圖，對菌株WG35基因組進行PCR擴增，得到大小約1 500 bp的單一條帶(圖4)。經T載體克隆后進行序列測定，測序結果表明，菌株WG35的16S rDNA序列擴增片段長度為1 513 bp(圖5)。將測序所得序列在GenBank中進行同源性比，結果表明，該序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA相似性最高，達到99%。

以相似性為基礎選取不同的芽孢桿菌的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0軟件構建菌株WG35的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可知，WG35在系統(tǒng)發(fā)育樹上與Bacillus subtilis進化距離較近，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支上。說明該菌株在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學上屬于Bacillus subtilis。

2.2 漆酶對造紙廢水的降解結果 BOD/COD比值反映的是污水的可生化降解性。菌株WG35所產的漆酶粗提液加入造紙黑液后第2天和第3天，造紙黑液中BOD/COD比值分別為0.39和0.85。可見，加入漆酶后第3天的黑液可降解性比第2天增加了近1倍。經漆酶處理后，造紙黑液的可生化性較好，有利于后續(xù)處理。

3 結語

漆酶從發(fā)現(xiàn)至今已有百余年的歷史了，漆酶在各方面的優(yōu)越性能使得人們對其關注度越來越高。漆酶來源廣泛，多種生物都能夠產生漆酶。雖然關于漆酶的研究已經取得較大的進展，但是但關于細菌漆酶報道的仍然很少。篩選得到的菌株WG35，經鑒定屬枯草芽孢桿菌。細菌漆酶具有適應pH范圍廣，易控制生長條件等優(yōu)點，且在異源表達和重組方面比真菌漆酶更具有優(yōu)勢。因此，基于細菌漆酶的生長特性，繼續(xù)深入地研究WG35菌株，探索其酶學性質以及產酶機制具有很重要的意義。

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