孫杉杉，朱瑞艷，杜迎輝，徐志文 (領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司，河北秦皇島066000)

花生是一年生豆科植物，有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，富含維生素、蛋白質(zhì)和脂肪，是世界上種植面積最大的油料作物，在我國各地均有種植。作為我國主要的油、糧兩用作物，花生是營養(yǎng)比較全面的作物食品［1］。

花生根瘤菌能與花生形成共生根瘤，固定空氣中的氮?dú)猓瑸橹参锷L提供營養(yǎng)，提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，可使花生在貧瘠的土壤中生長?；ㄉ鼍c花生通過有效的共生固氮作用可提供花生生育期有效氮素的50%［2］。因此，用高效固氮根瘤菌菌株制成的根瘤菌菌劑應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有效果好、成本低、不污染環(huán)境、增加土壤氮素、提高土壤肥力的作用［3］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。固體和液體培養(yǎng)均使用YMA培養(yǎng)基，組成為:10 g甘露醇、0.8 g酵母浸膏粉、0.25 g 磷酸氫二鉀、0.25 g磷酸二氫鉀、0.2 g硫酸鎂、0.1 g氯化鈉、15～20 g瓊脂、1 000 ml蒸餾水，pH 6.8 ～7.0。

1.1.2 土樣。從山東、河北、河南、遼寧4個(gè)花生種植地區(qū)，取回20個(gè)土樣。

1.1.3 花生品種。供試品種為冀花4號

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生根瘤菌的捕捉。將10 g土壤樣與90 g無菌水加到三角瓶中，振蕩搖勻，得到10-1稀釋度的土壤懸液;取10 ml土壤懸液，加90 ml無菌水，振蕩搖勻，得到10-2稀釋度的土壤懸液;按照同樣方式，制備得到10-3、10-4、10-5稀釋度的土壤懸液。

將1 ml上述土壤懸液接種到花盆中(花生種子已萌芽)，在花盆中以蛭石為培養(yǎng)介質(zhì)對花生種子進(jìn)行培養(yǎng)，定期澆灌常規(guī)低氮培養(yǎng)液。在培養(yǎng)1～2個(gè)月后，收獲的植物均有根瘤［4］。

1.2.2 根瘤菌的分離、純化。

1.2.2.1 分離。將根瘤洗凈，用剪刀剪下，帶點(diǎn)根，選取個(gè)大、粉紅的，分別按編號放入離心管中，加濃度95%乙醇浸泡30 s，以消除表面張力，倒出后直接加濃度0.2%的氯化汞消毒2～5 min，然后用無菌水沖洗五六次，用無菌不銹鋼釬子搗碎，用接種環(huán)蘸取汁液劃線接種于斜面試管，重復(fù)1次。

1.2.2.2 純化。先準(zhǔn)備好帶玻璃珠加水的無菌試管或離心管一支，從試管長出的菌落上挑取一環(huán)于管內(nèi)水中，振蕩1 min制成均勻、分散的菌懸液，取一環(huán)在YMA培養(yǎng)皿上劃線接種，重復(fù)1次，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，3 d后觀察菌落生長情況，如不純，按上法反復(fù)純化［4］。

1.2.3 根瘤菌的回接結(jié)瘤試驗(yàn)。將之前純化好的菌種用YMA培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成發(fā)酵液備用。將蛭石裝入小花盆中，加入低氮培養(yǎng)液至飽和，高壓滅菌。將事先萌芽好的健康、芽長一致的花生種子栽入花盆中，在種子周圍加入事先培養(yǎng)好的發(fā)酵液1 ml。種植1～2個(gè)月后觀察。

1.2.4 根瘤菌的鑒定。樣品總DNA的制備按常規(guī)的細(xì)菌DNA提取方法進(jìn)行。PCR引物有正向引物27F，反向引物1492R。PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)液組成為:1 μl DNA模板，10 μl 2 ×MastarMix，0.4 μl 27F ，0.4 μl 1492R，超純水補(bǔ)足至20 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 2 min;30個(gè)循環(huán)(84℃ 1 min，52℃ 1 min，65 ℃ 8 min);65 ℃ 18 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送北京三博遠(yuǎn)志公司測序。將測到的DNA序列進(jìn)行人工矯正后，使用NCBI中的BIAST軟件在線比對。經(jīng)比對，所鑒定的9個(gè)菌株與大豆根瘤菌的相似度為99%。所以，斷定這9個(gè)菌株均為根瘤菌屬。在回接試驗(yàn)中，與花生有較好的結(jié)瘤效果，于是可以確定它們?yōu)榛ㄉ鼍?/p>

1.2.5 盆栽試驗(yàn)?；ㄉ砻嫦竞蟠哐?～10 d;制備各個(gè)試驗(yàn)菌株的發(fā)酵液;選取芽長一致的花生種子，在發(fā)酵液中浸泡10 min后移入裝有蛭石的花盆(13×15 cm)中培養(yǎng);每盆留1株苗，一個(gè)菌株為1組，每組8個(gè)平行，另外設(shè)計(jì)以清水浸種的空白一組，對照菌株一組。定期澆水，調(diào)查，種植4個(gè)月以后收獲。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌的捕捉、分離、純化 對20個(gè)土樣進(jìn)行根瘤菌的捕捉、分離、純化，最終獲得20株野生型菌株。

2.2 根瘤菌的回接試驗(yàn) 確定根瘤分離物是否為共生細(xì)菌的最好方法是回接試驗(yàn)。只有在原宿主上回接結(jié)瘤，才能確定是哪種植物的根瘤菌。

將活的20株野生菌株分別與花生進(jìn)行結(jié)瘤試驗(yàn)。經(jīng)過近2個(gè)月的培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)菌株與宿主花生有較好的結(jié)瘤效果，在不同程度地促進(jìn)植物生長，而其他11個(gè)菌株結(jié)瘤效果較差，促生長效果不明顯，有些還會使作物根部變成褐色。因此，經(jīng)過初篩，初步確定有9個(gè)菌株為花生根瘤菌。

2.3 花生根瘤菌的16s rDNA鑒定和生理生化鑒定 經(jīng)過16s測序，與大豆根瘤菌基因的相似度達(dá)99%以上，為根瘤菌屬。結(jié)合回接試驗(yàn)結(jié)果，可以確定該9株根瘤菌為花生根瘤菌。

將9個(gè)菌株分別接種在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中，在溫度28℃下培養(yǎng)5 d。如果培養(yǎng)液澄清，菌體未見生長，與未接種菌株的對照相同，那么表明該菌株不能在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上生長。將9個(gè)菌株分別在BTB平板上溫度28℃下培養(yǎng)7 d。如果平板顏色變藍(lán)，那么說明該菌株在BTB平板上產(chǎn)堿，屬于慢生型菌株。將9個(gè)菌株分別在石蕊牛奶培養(yǎng)基中28℃下培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基顏色變藍(lán)，并且形成乳清環(huán)，表明該菌株產(chǎn)堿，屬于慢生型。3-酮基乳糖反應(yīng)呈陰性，菌落周圍未出現(xiàn)黃褐色沉淀，表明該菌株為非土壤桿菌。通過上述方法，判定所篩選的9個(gè)菌株均為慢生型花生根瘤菌。

2.4 花生根瘤菌盆栽試驗(yàn)結(jié)果 分離的9株慢生型花生根瘤菌按采集地區(qū)分別命名為 ZMW、LX、XCW、XWW、YS、YSW、ZW、DMW、WDW。另取該公司公開銷售的一株花生根瘤菌株144，將上述10個(gè)菌株進(jìn)行盆栽比較試驗(yàn)。按照常規(guī)的調(diào)查方法，待花生植株生長到花期時(shí)，開始調(diào)查結(jié)瘤數(shù)、干重、全氮，培養(yǎng)約4個(gè)月時(shí)調(diào)查產(chǎn)量。

由表1～4可知，與對照相比，施用過花生根瘤菌WDW菌液的花生植株單株結(jié)瘤數(shù)提高925.6%，單株干重提高63.6%，單株全氮含量提高18.1%，單株產(chǎn)量提高57.9%。與現(xiàn)有生產(chǎn)使用的花生根瘤菌144相比，單株結(jié)瘤數(shù)提高27.4%，單株干重提高8.7%，單株全氮含量提高6.5%，單株產(chǎn)量提高30.45%。所選的花生根瘤菌菌株WDW能明顯提高結(jié)瘤量和產(chǎn)量，提高植物的固氮能力，有效促進(jìn)植物的生長發(fā)育。

3 結(jié)論與討論

研究中，只對植株的結(jié)瘤數(shù)、干重、全氮和產(chǎn)量進(jìn)行了調(diào)查，沒有對固氮酶活力進(jìn)行研究。但是，有研究表明，結(jié)瘤數(shù)與固氮酶活性間也有一定的關(guān)系。張宏等［5-7］研究也闡述了這一規(guī)律。另外，根瘤菌存在一定的地域性［8-10］，所以在菌劑的開發(fā)和實(shí)際的應(yīng)用過程中要因地制宜。

［1］吳海燕.花生根瘤菌高效菌株的篩選及固氮效果研究［D］.長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［2］李力曹，曹鳳明，徐玲玫，等.花生根瘤菌的抗逆性初步研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2000，27(1):42-47.

［3］劉惠琴.根瘤菌肥料及其應(yīng)用［J］.土壤肥料，1994(1):37-40.

［4］陳文新，汪恩濤.中國根瘤菌［M］.北京:科學(xué)出版社，2011.

［5］張宏，張桂芝，趙貴彬，等.黑土中土著大豆根瘤菌的固氮活性、結(jié)瘤性狀和固氮量估測［J］.大豆科學(xué)，1986，5(1):47-56.

［6］肖亦農(nóng)，徐瓊.大豆根瘤菌HH103菌株培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(6):92-95.

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［9］楊江科，謝福莉，周俊初.江漢平原及其周邊地區(qū)花生根瘤菌的遺傳多樣性［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，23(3):504-511.

［10］劉杰，汪玲玲，汪恩濤，等.河北地區(qū)花生根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(2):344-352.