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        一株高效慢生型花生根瘤菌的篩選

        2015-12-22 01:49:08孫杉杉朱瑞艷杜迎輝徐志文領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司河北秦皇島066000
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年12期

        孫杉杉,朱瑞艷,杜迎輝,徐志文 (領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司,河北秦皇島066000)

        花生是一年生豆科植物,有豐富的營養(yǎng)價(jià)值,富含維生素、蛋白質(zhì)和脂肪,是世界上種植面積最大的油料作物,在我國各地均有種植。作為我國主要的油、糧兩用作物,花生是營養(yǎng)比較全面的作物食品[1]。

        花生根瘤菌能與花生形成共生根瘤,固定空氣中的氮?dú)猓瑸橹参锷L提供營養(yǎng),提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì),可使花生在貧瘠的土壤中生長?;ㄉ鼍c花生通過有效的共生固氮作用可提供花生生育期有效氮素的50%[2]。因此,用高效固氮根瘤菌菌株制成的根瘤菌菌劑應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有效果好、成本低、不污染環(huán)境、增加土壤氮素、提高土壤肥力的作用[3]。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 培養(yǎng)基。固體和液體培養(yǎng)均使用YMA培養(yǎng)基,組成為:10 g甘露醇、0.8 g酵母浸膏粉、0.25 g 磷酸氫二鉀、0.25 g磷酸二氫鉀、0.2 g硫酸鎂、0.1 g氯化鈉、15~20 g瓊脂、1 000 ml蒸餾水,pH 6.8 ~7.0。

        1.1.2 土樣。從山東、河北、河南、遼寧4個(gè)花生種植地區(qū),取回20個(gè)土樣。

        1.1.3 花生品種。供試品種為冀花4號

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 花生根瘤菌的捕捉。將10 g土壤樣與90 g無菌水加到三角瓶中,振蕩搖勻,得到10-1稀釋度的土壤懸液;取10 ml土壤懸液,加90 ml無菌水,振蕩搖勻,得到10-2稀釋度的土壤懸液;按照同樣方式,制備得到10-3、10-4、10-5稀釋度的土壤懸液。

        將1 ml上述土壤懸液接種到花盆中(花生種子已萌芽),在花盆中以蛭石為培養(yǎng)介質(zhì)對花生種子進(jìn)行培養(yǎng),定期澆灌常規(guī)低氮培養(yǎng)液。在培養(yǎng)1~2個(gè)月后,收獲的植物均有根瘤[4]。

        1.2.2 根瘤菌的分離、純化。

        1.2.2.1 分離。將根瘤洗凈,用剪刀剪下,帶點(diǎn)根,選取個(gè)大、粉紅的,分別按編號放入離心管中,加濃度95%乙醇浸泡30 s,以消除表面張力,倒出后直接加濃度0.2%的氯化汞消毒2~5 min,然后用無菌水沖洗五六次,用無菌不銹鋼釬子搗碎,用接種環(huán)蘸取汁液劃線接種于斜面試管,重復(fù)1次。

        1.2.2.2 純化。先準(zhǔn)備好帶玻璃珠加水的無菌試管或離心管一支,從試管長出的菌落上挑取一環(huán)于管內(nèi)水中,振蕩1 min制成均勻、分散的菌懸液,取一環(huán)在YMA培養(yǎng)皿上劃線接種,重復(fù)1次,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),3 d后觀察菌落生長情況,如不純,按上法反復(fù)純化[4]。

        1.2.3 根瘤菌的回接結(jié)瘤試驗(yàn)。將之前純化好的菌種用YMA培養(yǎng)基培養(yǎng),制成發(fā)酵液備用。將蛭石裝入小花盆中,加入低氮培養(yǎng)液至飽和,高壓滅菌。將事先萌芽好的健康、芽長一致的花生種子栽入花盆中,在種子周圍加入事先培養(yǎng)好的發(fā)酵液1 ml。種植1~2個(gè)月后觀察。

        1.2.4 根瘤菌的鑒定。樣品總DNA的制備按常規(guī)的細(xì)菌DNA提取方法進(jìn)行。PCR引物有正向引物27F,反向引物1492R。PCR反應(yīng)體系20 μl,反應(yīng)液組成為:1 μl DNA模板,10 μl 2 ×MastarMix,0.4 μl 27F ,0.4 μl 1492R,超純水補(bǔ)足至20 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 2 min;30個(gè)循環(huán)(84℃ 1 min,52℃ 1 min,65 ℃ 8 min);65 ℃ 18 min。

        擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送北京三博遠(yuǎn)志公司測序。將測到的DNA序列進(jìn)行人工矯正后,使用NCBI中的BIAST軟件在線比對。經(jīng)比對,所鑒定的9個(gè)菌株與大豆根瘤菌的相似度為99%。所以,斷定這9個(gè)菌株均為根瘤菌屬。在回接試驗(yàn)中,與花生有較好的結(jié)瘤效果,于是可以確定它們?yōu)榛ㄉ鼍?/p>

        1.2.5 盆栽試驗(yàn)?;ㄉ砻嫦竞蟠哐?~10 d;制備各個(gè)試驗(yàn)菌株的發(fā)酵液;選取芽長一致的花生種子,在發(fā)酵液中浸泡10 min后移入裝有蛭石的花盆(13×15 cm)中培養(yǎng);每盆留1株苗,一個(gè)菌株為1組,每組8個(gè)平行,另外設(shè)計(jì)以清水浸種的空白一組,對照菌株一組。定期澆水,調(diào)查,種植4個(gè)月以后收獲。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 根瘤菌的捕捉、分離、純化 對20個(gè)土樣進(jìn)行根瘤菌的捕捉、分離、純化,最終獲得20株野生型菌株。

        2.2 根瘤菌的回接試驗(yàn) 確定根瘤分離物是否為共生細(xì)菌的最好方法是回接試驗(yàn)。只有在原宿主上回接結(jié)瘤,才能確定是哪種植物的根瘤菌。

        將活的20株野生菌株分別與花生進(jìn)行結(jié)瘤試驗(yàn)。經(jīng)過近2個(gè)月的培養(yǎng)觀察,發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)菌株與宿主花生有較好的結(jié)瘤效果,在不同程度地促進(jìn)植物生長,而其他11個(gè)菌株結(jié)瘤效果較差,促生長效果不明顯,有些還會使作物根部變成褐色。因此,經(jīng)過初篩,初步確定有9個(gè)菌株為花生根瘤菌。

        2.3 花生根瘤菌的16s rDNA鑒定和生理生化鑒定 經(jīng)過16s測序,與大豆根瘤菌基因的相似度達(dá)99%以上,為根瘤菌屬。結(jié)合回接試驗(yàn)結(jié)果,可以確定該9株根瘤菌為花生根瘤菌。

        將9個(gè)菌株分別接種在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中,在溫度28℃下培養(yǎng)5 d。如果培養(yǎng)液澄清,菌體未見生長,與未接種菌株的對照相同,那么表明該菌株不能在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上生長。將9個(gè)菌株分別在BTB平板上溫度28℃下培養(yǎng)7 d。如果平板顏色變藍(lán),那么說明該菌株在BTB平板上產(chǎn)堿,屬于慢生型菌株。將9個(gè)菌株分別在石蕊牛奶培養(yǎng)基中28℃下培養(yǎng)7 d,培養(yǎng)基顏色變藍(lán),并且形成乳清環(huán),表明該菌株產(chǎn)堿,屬于慢生型。3-酮基乳糖反應(yīng)呈陰性,菌落周圍未出現(xiàn)黃褐色沉淀,表明該菌株為非土壤桿菌。通過上述方法,判定所篩選的9個(gè)菌株均為慢生型花生根瘤菌。

        2.4 花生根瘤菌盆栽試驗(yàn)結(jié)果 分離的9株慢生型花生根瘤菌按采集地區(qū)分別命名為 ZMW、LX、XCW、XWW、YS、YSW、ZW、DMW、WDW。另取該公司公開銷售的一株花生根瘤菌株144,將上述10個(gè)菌株進(jìn)行盆栽比較試驗(yàn)。按照常規(guī)的調(diào)查方法,待花生植株生長到花期時(shí),開始調(diào)查結(jié)瘤數(shù)、干重、全氮,培養(yǎng)約4個(gè)月時(shí)調(diào)查產(chǎn)量。

        由表1~4可知,與對照相比,施用過花生根瘤菌WDW菌液的花生植株單株結(jié)瘤數(shù)提高925.6%,單株干重提高63.6%,單株全氮含量提高18.1%,單株產(chǎn)量提高57.9%。與現(xiàn)有生產(chǎn)使用的花生根瘤菌144相比,單株結(jié)瘤數(shù)提高27.4%,單株干重提高8.7%,單株全氮含量提高6.5%,單株產(chǎn)量提高30.45%。所選的花生根瘤菌菌株WDW能明顯提高結(jié)瘤量和產(chǎn)量,提高植物的固氮能力,有效促進(jìn)植物的生長發(fā)育。

        3 結(jié)論與討論

        研究中,只對植株的結(jié)瘤數(shù)、干重、全氮和產(chǎn)量進(jìn)行了調(diào)查,沒有對固氮酶活力進(jìn)行研究。但是,有研究表明,結(jié)瘤數(shù)與固氮酶活性間也有一定的關(guān)系。張宏等[5-7]研究也闡述了這一規(guī)律。另外,根瘤菌存在一定的地域性[8-10],所以在菌劑的開發(fā)和實(shí)際的應(yīng)用過程中要因地制宜。

        [1]吳海燕.花生根瘤菌高效菌株的篩選及固氮效果研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2002.

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        [3]劉惠琴.根瘤菌肥料及其應(yīng)用[J].土壤肥料,1994(1):37-40.

        [4]陳文新,汪恩濤.中國根瘤菌[M].北京:科學(xué)出版社,2011.

        [5]張宏,張桂芝,趙貴彬,等.黑土中土著大豆根瘤菌的固氮活性、結(jié)瘤性狀和固氮量估測[J].大豆科學(xué),1986,5(1):47-56.

        [6]肖亦農(nóng),徐瓊.大豆根瘤菌HH103菌株培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志,2011,31(6):92-95.

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        [9]楊江科,謝福莉,周俊初.江漢平原及其周邊地區(qū)花生根瘤菌的遺傳多樣性[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2003,23(3):504-511.

        [10]劉杰,汪玲玲,汪恩濤,等.河北地區(qū)花生根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(2):344-352.

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