劉茹，曹玲麗，劉霞，舒曉燕，侯大斌(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010)

柴胡為臨床常用中藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。傘形科植物北柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狹葉柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根是2010年版《中國藥典》一部收載的正品柴胡［1］。藥理研究表明柴胡具有解熱、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗腫瘤等作用［2－3］。柴胡化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖類等［4－5］。近幾年，藥材市場(chǎng)正面臨著藥用資源短缺的問題，柴胡的馴化栽培已經(jīng)存在，但長期栽培易導(dǎo)致柴胡品種退化、病害發(fā)生，從而導(dǎo)致柴胡產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，脫毒培養(yǎng)獲得無毒苗很有必要，再大量繁殖可以恢復(fù)品種特性，以滿足生產(chǎn)需要。此外，利用外植體組織培養(yǎng)與超低溫條件可以長期保存，給離體保存的種植資源引種提供方便［6－8］。

組織培養(yǎng)中首先要解決且較難控制的問題是污染，如果不能將污染率降低到一定范圍內(nèi)，組織培養(yǎng)技術(shù)就失去了推廣的意義，工藝也難以進(jìn)行下去。在自然條件下，作為外植體的植物材料，無論外部還是內(nèi)部都帶有很多細(xì)菌和霉菌。因此，探索外植體的最佳消毒條件是柴胡組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，也為其進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料為北柴胡新審定品系“川北柴1號(hào)”種子。“川北柴1號(hào)”系四川德培源公司選育，在四川多年多點(diǎn)品比試驗(yàn)中具有良好適應(yīng)性，該品系已在2014年通過品系審定。

1.2 試驗(yàn)方法 將“川北柴1號(hào)”種子在流水下沖洗4 h，用70%乙醇浸泡50 s，無菌水沖洗3次后浸泡在消毒劑中進(jìn)行消毒，無菌水沖洗至無明顯顏色出現(xiàn)為止。消毒試驗(yàn)設(shè)計(jì)9個(gè)處理(表1)。用無菌濾紙吸干消毒處理后種子上的蒸餾水，接種到 MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種一個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)其污染率和存活率。比較消毒效果，篩選最佳外植體消毒條件。

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基都以MS為基本培養(yǎng)基，以6 g/L瓊脂粉為固化劑，附加30 g蔗糖，pH在5.8～6.0。培養(yǎng)箱溫度在(25±1)℃。光照強(qiáng)度為2 000 lx。光照時(shí)間為14 h/d。

表1 不同消毒處理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

計(jì)算公式:

污染率=(污染的柴胡種子數(shù)/接種的柴胡種子總數(shù))×100%

存活率=(存活的柴胡種子數(shù)/接種的柴胡種子總數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)柴胡外植體的消毒效果 由表2可知，25 g/L NaClO消毒處理柴胡種子5 min的效果最差，污染率為100%;100 g/L NaClO消毒處理柴胡種子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，存活率為86.7%。

用100 g/L NaClO消毒處理柴胡種子，不同時(shí)間外植體消毒效果見圖1。由圖1可知，隨著消毒時(shí)間的增加柴胡外植體污染率降低，最低為6.7%，成活率上升，最高86.7%。因此，消毒時(shí)間為30 min時(shí)消毒效果最佳。

表2 不同消毒條件對(duì)柴胡外植體的影響

2.2 不同濃度NaClO對(duì)柴胡外植體的消毒效果 選定30 min為最佳消毒時(shí)間，考察不同濃度NaClO的消毒效果，發(fā)現(xiàn)NaClO濃度為25 g/L時(shí)消毒效果最差，污染率達(dá)66.7%。NaClO濃度為100 g/L時(shí)消毒效果最好，污染率僅為6.7%，成活率為86.7%。為獲得更好的消毒效果，將Na-ClO濃度提高到200 g/L，發(fā)現(xiàn)其污染率升高，而外植體的存活率由86.7%降低為80%(圖2)。因此，消毒劑NaClO最佳消毒濃度為100 g/L。

方差分析表明，NaClO濃度對(duì)柴胡外植體消毒的污染率和存活率有極顯著影響(P＜0.01)。消毒時(shí)間對(duì)柴胡外植體消毒的污染率和存活率有顯著影響(P＜0.05)。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中的首個(gè)問題就是控制污染率，一般而言，污染率應(yīng)控制在8%以內(nèi)，但在實(shí)際生產(chǎn)中污染率達(dá)20%，有時(shí)高達(dá)50%，甚至100%［9］。組織培養(yǎng)中消毒劑既要?dú)绮牧仙系牟【?，也要易被蒸餾水沖洗掉或自行分解，而且不會(huì)損傷或輕微損傷組織，影響其生長。因此，該研究選擇的消毒劑為NaClO，殺菌效果好，且易清除干凈。此外，消毒過程中要選擇合適的濃度和時(shí)間，低濃度的NaClO不能使外植體消毒徹底，高濃度又會(huì)破壞外植體的細(xì)胞，細(xì)胞處于自我保護(hù)，會(huì)產(chǎn)生大量的次生物質(zhì)，引起細(xì)胞毒害，導(dǎo)致外植體褐變甚至死亡。若消毒時(shí)間過長會(huì)對(duì)外植體造成一定程度損傷，產(chǎn)生次生代謝物，毒害細(xì)胞，使外植體死亡率增加;如果為了降低死亡率減少消毒時(shí)間，就會(huì)導(dǎo)致消毒不徹底，污染率升高。因此，消毒劑濃度和消毒時(shí)間對(duì)組織培養(yǎng)中滅菌過程有顯著影響。選擇合適的消毒劑和相對(duì)適宜的消毒時(shí)間成為“川北柴1號(hào)”組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵。

該研究選用柴胡種子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，以期為推廣柴胡新品種“川北柴1號(hào)”尋求最佳繁殖模式。該試驗(yàn)采用不同濃度的NaClO對(duì)柴胡種子進(jìn)行消毒處理，得到“川北柴1號(hào)”組織培養(yǎng)中最佳外植體消毒條件:100 g/L Na-ClO處理柴胡種子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，成活率86.7%。王騰越等［10］研究了土沉香外植體的最佳消毒方法，污染率43.33%，成活率31.67%。李鍵等［11］研究了雷公藤外植體最佳消毒條件，污染率21.08%，成活率65.66%。林妃等［12］研究了花梨木外植體的最佳消毒方法，污染率40.0%，成活率51.4%。因此，相對(duì)于這些植物的消毒效果，柴胡組織培養(yǎng)中污染率可以得到控制。這可能是因?yàn)樵撛囼?yàn)選擇的外植體為柴胡種子，本身體積小，攜帶的細(xì)菌少且消毒劑的危害不大。因?yàn)榻M織培養(yǎng)中污染率不僅與消毒劑的濃度及消毒時(shí)間有關(guān)，也可能是由于接種過程中培養(yǎng)材料被污染或是培養(yǎng)過程中環(huán)境的溫度、濕度不合適造成的。所以在組織培養(yǎng)接種過程中要注意工作臺(tái)面的干凈，使用鑷子等工具要預(yù)先進(jìn)行乙醇消毒;也要選擇濕度、溫度都適宜且病菌少的環(huán)境。此外，組織培養(yǎng)中的存活率不僅與消毒劑及消毒時(shí)間有關(guān)，也可能是材料本身相對(duì)老化或者是培養(yǎng)基激素影響。因此，要保證組織培養(yǎng)中材料低污染率高存活率，除選擇最佳的消毒處理，也須選擇合適的外植體、適宜的生長激素和環(huán)境。

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