田新華，翁海龍，曹焱，郭樹平(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱150081)

黃樹莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種維生素、氨基酸和礦質(zhì)元素、鞣化酸、超氧化物岐化酶(SOD)等特殊生理活性物質(zhì)［1－2］。果實(shí)鮮黃，氣味芳香，入口先酸后甜，深受歐美等國歡迎，既可鮮食果品，又可加工成果汁、罐頭等多種食品。同時(shí)黃樹莓葉片提取物粗黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，具有降血糖、降血脂、抗氧化高效性與低毒性等生理活性［3］。

然而植株受病毒感染積累，導(dǎo)致葉片黃化、產(chǎn)量下降，果實(shí)品質(zhì)變劣且可遺傳給后代，給生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了黃樹莓優(yōu)良品種的推廣。

國外采用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行苗木的脫毒快繁［4］，既可保持植物的優(yōu)良特性和性狀，又防止品種過快退化，生產(chǎn)上己實(shí)現(xiàn)了無毒苗良種化［5］。目前，黃樹莓優(yōu)質(zhì)苗木的快速生產(chǎn)與無毒苗的大力推廣己成為制約我國黃樹莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸因素。因此，筆者對(duì)引進(jìn)優(yōu)質(zhì)黃樹莓品種展開組培脫毒快繁技術(shù)研究，旨在提出一套完整的苗木脫毒培養(yǎng)技術(shù)體系，為無毒苗木的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理 供試材料為黑龍江省園藝分院引進(jìn)的美國黃樹莓，采集一年生枝條為外植體，用刀片切去葉片及部分葉柄，先用洗滌劑清洗一遍，然后流水沖洗30 min，剪取長(zhǎng)1.0～2.0 cm的帶芽莖段，在超凈工作臺(tái)上用0.1%氯化汞溶液表面滅菌，滅菌時(shí)間分別為4、6、8 min 3種處理，滅菌后用無菌水沖洗3次，并于無菌水中浸泡40～60 min后取出用無菌濾紙吸干材料表面多余水分，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)。剪去莖段兩端多余部分后，在無菌條件下將單芽莖段接種于MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+GA30.5 mg/L培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選芽增殖培養(yǎng)基。待莖段腋芽伸長(zhǎng)后，分別轉(zhuǎn)接于以MS為基本培養(yǎng)基，以6-芐基腺嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)為3個(gè)因素，每因素設(shè)置3個(gè)水平，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)基篩選(表1)。每個(gè)處理2次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10瓶，培養(yǎng)35 d后調(diào)查結(jié)果。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選生根培養(yǎng)基。剪取苗高1.5～2.0 cm的單芽莖段，分別轉(zhuǎn)接于以下5種生根培養(yǎng)基:①1/2MS+IBA 0.2 mg/L;②1/2MS+IBA 0.4 mg/L;③1/2MS+NAA 0.2 mg/L;④1/2MS+NAA 0.4 mg/L;⑤1/2MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L中進(jìn)行試管苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后調(diào)查結(jié)果。每個(gè)處理2次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10瓶。上述培養(yǎng)基均加蔗糖30 g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6 g/L，pH調(diào)至5.8。

以上培養(yǎng)條件均為:白天溫度(25±1)℃，夜間溫度(20±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.4 試管苗移栽試驗(yàn)。將已經(jīng)生根的黃樹莓試管苗在常溫、自然光下逐漸揭開封口膜，煉苗3～5 d，初期每天噴霧4次，逐漸減少噴霧次數(shù)。然后將苗取出，用清水洗去根部培養(yǎng)基，再用0.1%的代森鋅溶液浸泡15 min，移栽到用0.5%高錳酸鉀溶液消毒的以下基質(zhì)中:①草炭;②樹皮+闊葉(1∶1);③針葉+樹皮+草腐菌菌糠(1∶1∶1);④草炭+稻殼+樹皮(1∶1∶1);⑤針葉+鋸末(1∶1)中。用塑料膜覆蓋7 d保持空氣相對(duì)濕度在75%左右，適當(dāng)噴水。每個(gè)處理栽種30株，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)成活率及苗木生長(zhǎng)狀況。

1.2.5 黃樹莓莖尖脫毒試驗(yàn)

1.2.5.1 微莖尖脫毒培養(yǎng)試驗(yàn)。將生長(zhǎng)良好的試管苗切成單芽莖段，在100×顯微鏡下用解剖針剝?nèi)△[片和葉原基(解剖針放入0.1%的HgCl2溶液中滅菌10 min，然后用無菌水反復(fù)沖洗干凈)，當(dāng)形狀為一個(gè)閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來時(shí)，用手術(shù)刀片將莖尖分生組織切下，分別切取 0.1、0.2、0.5 mm 微莖尖接入培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 30、80、130 d分別觀察并記錄。

1.2.5.2 微莖尖脫毒培養(yǎng)基礎(chǔ)上的熱處理試驗(yàn)。將繼代或生根的莖尖脫毒苗置于光照培養(yǎng)箱中，用熱空氣處理脫毒。相對(duì)濕度保持75% ～85%，光照強(qiáng)度為2 500～3 000 lx，光周期14 h/10 h(光照/黑暗)。然后通過初始25℃，25～36℃每天增加0.5℃，36～38℃時(shí)每2 d增加0.5℃，38℃時(shí)保持7 d，此后再每2 d增加0.5℃，隨時(shí)觀察記錄結(jié)果，當(dāng)有植株出現(xiàn)嚴(yán)重燙傷癥狀或枯死時(shí)停止加溫，準(zhǔn)備二次切取莖尖。供試苗木10株，重復(fù)2次，記錄熱處理效果。

1.2.5.3 熱處理脫毒基礎(chǔ)上的二次微莖尖脫毒試驗(yàn)。將經(jīng)過熱處理且生長(zhǎng)較好的試管苗放在超凈工作臺(tái)上，置于100×顯微鏡下，剝?nèi)∥⑶o尖，方法與“1.2.5.2”同。此次剝?nèi)?.5 mm的長(zhǎng)度進(jìn)行二次微莖尖培養(yǎng)，30、60、90 d分別觀察結(jié)果并記錄。

1.2.5.4 病毒檢測(cè)。運(yùn)用酶聯(lián)檢測(cè)儀(ELISA)進(jìn)行脫毒結(jié)果檢測(cè)。

1.2.5.5 脫毒苗增殖和生根試驗(yàn)。將經(jīng)病毒檢測(cè)后的黃樹莓脫毒苗參照上述增殖、生根培養(yǎng)試驗(yàn)所得出的最佳培養(yǎng)方法，重復(fù)擴(kuò)繁生根培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件DPS7.05對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和差異顯著性測(cè)驗(yàn)(SSR法)［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)黃樹莓外植體的影響 在接種后第3天觀察外植體，發(fā)現(xiàn)滅菌不徹底的莖段開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象。經(jīng)氯化汞滅菌4 min的試材污染率較高;滅菌4 min和6 min的試材均無褐化現(xiàn)象，滅菌8 min的試材無污染但部分外植體切口處出現(xiàn)褐化。這說明氯化汞滅菌6 min可以達(dá)到滅菌的目的，且對(duì)黃樹莓外植體無損傷(表2)。

2.2 誘導(dǎo)黃樹莓側(cè)芽生長(zhǎng)情況 觀察表明，腋芽在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d開始萌動(dòng)，培養(yǎng)7 d節(jié)間伸長(zhǎng)，小葉片展開。

2.3 不同處理對(duì)黃樹莓苗木增殖的影響 將伸長(zhǎng)的莖梢切成莖段，單芽莖段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。對(duì)不同處理增殖培養(yǎng)35 d的試管苗進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明，對(duì)于株高影響最大的因素是GA3(B)，說明赤霉素的含量直接影響試管苗的向上生長(zhǎng)速度，在該試驗(yàn)所選定的濃度范圍內(nèi)，試管苗的株高隨赤霉素含量的升高而增加;6-BA(A)是影響試管苗增殖培養(yǎng)的主要因素，且在該試驗(yàn)所選定的濃度范圍內(nèi)，試管苗的增殖分化數(shù)隨6-BA含量的增加而增加。方差分析結(jié)果表明，A、B、C因素間差異極顯著(P＜0.01)。植株上部生長(zhǎng)情況的多重比較結(jié)果顯示，以處理③培養(yǎng)的試管苗向高生長(zhǎng)最快，且處理間差異顯著;以處理⑧培養(yǎng)的試管苗分化增殖苗數(shù)最多，且與其他處理間差異顯著(P＜0.05)。對(duì)于分化增殖培養(yǎng)而言，在保證試管苗增殖率的前提下，應(yīng)選擇苗木生長(zhǎng)旺盛的處理。因此，選擇培養(yǎng)基(即處理⑧)MS+6-BA 2.0 mg/L+GA30.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L 為黃樹莓的分化增殖培養(yǎng)基，分化苗數(shù)較多，植株生長(zhǎng)健壯(表3)。

2.4 不同處理對(duì)黃樹莓試管苗生根的影響 當(dāng)苗高1.5～2.0 cm時(shí)，切取單芽分別轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d左右開始長(zhǎng)出白色的根，根較細(xì)，但根系密集，分支較多。對(duì)培養(yǎng)30 d的試管苗進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明無論從生根數(shù)量還是根長(zhǎng)方面，各處理間差異極顯著(P＜0.01)。經(jīng)SSR法多重比較結(jié)果(表4)表明，無論從生根數(shù)量還是根長(zhǎng)，均以處理①最好，經(jīng)處理①培養(yǎng)30 d的試管苗平均生根9.48條，長(zhǎng)度達(dá)2.0 cm。生根速度快，根系生長(zhǎng)旺盛，分支多，吸收能力強(qiáng)，有利于提高移栽成活率。因此，選擇培養(yǎng)基(即處理①)即1/2MS+IBA 0.2 mg/L為黃樹莓的生根培養(yǎng)基。

表4 不同處理苗木生根數(shù)量和生根長(zhǎng)度

2.5 黃樹莓試管苗移栽 由表5可知，處理③［即針葉+樹皮+草腐菌菌糠(1∶1∶1)］培養(yǎng)的苗木長(zhǎng)勢(shì)較好，莖桿相對(duì)粗壯，有效光合葉片數(shù)較多，易于有機(jī)物的合成與積累，有利于苗木進(jìn)一步生長(zhǎng)繁殖。

表5 移栽苗長(zhǎng)勢(shì)情況

2.6 黃樹莓莖尖脫毒培養(yǎng)研究

2.6.1 微莖尖脫毒培養(yǎng)效果。由于病毒在植物體內(nèi)分布不均性，莖尖沒有病毒或濃度較低。因此該試驗(yàn)采用生長(zhǎng)發(fā)育快的試管苗進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)。結(jié)果表明，不同規(guī)格的莖尖其顯綠時(shí)間、成苗時(shí)間和成苗率不同(表6)。

表6 微莖尖脫毒培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

采用不同程度的微莖尖脫毒處理，理論上莖尖越小帶毒概率越低，但綜合考慮苗木脫毒效率、成活率和成苗時(shí)間等因素，故采用0.2 mm作為微莖尖處理的最適長(zhǎng)度。0.5 mm莖尖的成苗率最高，但脫毒效果不好;0.1 mm的莖尖剝?nèi)±щy，且成苗率低。

2.6.2 微莖尖脫毒培養(yǎng)基礎(chǔ)上的熱處理脫毒效果。通過不同溫度處理的預(yù)試驗(yàn)與資料參考［7］，確定試管苗的耐熱溫度與極限溫度的保持時(shí)間，從而篩選出黃樹莓合理有效的熱處理脫毒途徑。

試驗(yàn)結(jié)果表明，通過初始25℃培養(yǎng)，然后采取溫度逐漸上升的方式，在38～40℃保持時(shí)間較長(zhǎng);繼代苗、生根苗所能承受的極限溫度也不同，分別為37.2和40.8℃，保持時(shí)間分別為13和15 d，此時(shí)導(dǎo)致病毒致死或鈍化。同時(shí)生根苗在各個(gè)溫度梯度的抗熱性明顯優(yōu)于繼代苗。

2.6.3 熱處理基礎(chǔ)上的二次微莖尖脫毒研究。由表7可知，利用腋芽進(jìn)行二次微莖尖處理比頂芽莖尖效果好，由于在極限溫度下，頂芽處于細(xì)胞分裂生長(zhǎng)時(shí)期，極限溫度導(dǎo)致其愈傷組織生理發(fā)生變異，玻璃化現(xiàn)象明顯，而腋芽在溫度適宜時(shí)形成，以后基本處于分化停滯階段，培養(yǎng)環(huán)境的劇烈溫度變化對(duì)其傷害相對(duì)較小。

表7 二次微莖尖脫毒培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

經(jīng)過上述脫毒培養(yǎng)的試管苗按照篩選出的苗木擴(kuò)繁、生根培養(yǎng)基配方培養(yǎng)，獲得脫毒組培苗木(圖1)。

3 結(jié)論與討論

(1)增殖培養(yǎng)是試管苗快速繁育的基礎(chǔ)，只有選擇合適的激素及濃度才有利于黃樹莓組培苗的生長(zhǎng)繁育。該試驗(yàn)結(jié)果表明，美國黃樹莓的最適增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+GA30.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，分化苗數(shù)較多，葉色深綠，植株生長(zhǎng)健壯。以1/2MS+IBA 0.2 mg/L為黃樹莓的生根培養(yǎng)基，生根率較高，生根速度快，根系生長(zhǎng)旺盛，分支多，吸收能力強(qiáng)，有利于提高移栽成活率。對(duì)于黃樹莓而言，激素IBA、NAA均可促進(jìn)其生根，說明它對(duì)于生根激素的要求較寬泛。

(2)該研究應(yīng)用二次微莖尖脫毒和熱處理脫毒相結(jié)合的脫毒措施對(duì)美國引進(jìn)黃樹莓進(jìn)行了研究，揭示了對(duì)黃樹莓用0.2、0.5 mm微莖尖進(jìn)行二次莖尖脫毒并結(jié)合熱處理的最佳脫毒方法，應(yīng)用ELISA特異性植物病毒檢測(cè)法對(duì)其脫毒效果進(jìn)行了檢測(cè)。該研究建立了黃樹莓全程脫毒苗工廠化育苗的快繁體系，應(yīng)用此技術(shù)模式可大規(guī)模進(jìn)行脫毒苗工廠化育苗，解決了目前制約我國黃樹莓產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的瓶頸問題，為快速建立我國黃樹莓產(chǎn)業(yè)基地與無毒苗良種化的大面積推廣起到了推動(dòng)作用。

(3)對(duì)于移栽試驗(yàn)而言，摻有稻殼的基質(zhì)黃樹莓試管苗成活率低，且此類基質(zhì)保水性差，極易失水，造成苗木萎蔫，不建議使用稻殼作為試管苗移栽基質(zhì)組成成分。

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