黃雅, 張春香, 楊智權(quán), 鄧燕, 梁敏, 張宇, 鄭清云, 申有名, 張向陽

?

基于雙氧水檢測的硼酸酯熒光探針的研究

黃雅, 張春香, 楊智權(quán), 鄧燕, 梁敏, 張宇, 鄭清云, 申有名, 張向陽

(湖南文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院, 湖南常德, 415000)

以鄰羥基苯乙酮和苯甲醛為原料經(jīng)過羥醛縮合反應(yīng)、氧化反應(yīng)以及取代反應(yīng), 合成了一種新型熒光探針, 其結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H NMR、MS進行了表征。利用熒光光譜, 探討了該探針對雙氧水響應(yīng)的光譜性能、選擇性、pH值以及反應(yīng)時間等因素。結(jié)果表明, 該探針能很好地對雙氧水進行檢測。

熒光探針; 雙氧水; 硼酸酯; 合成; 表征

作為一種重要的活性氧物質(zhì), 雙氧水在環(huán)境和生物活動中扮演著重要的角色。在環(huán)境中, 雙氧水可以用于自來水的凈化[1], 在生命活動中, 雙氧水在細胞中起著免疫標(biāo)志的功能[2], 同時過量的雙氧水會導(dǎo)致癌癥[3]、阿爾察默病等疾病[4]。因此, 在環(huán)境和生物體中對雙氧水的進行檢測具有重要的意義。

目前對雙氧水檢測的方法有比色法[5]、滴定法[6]、電化學(xué)法[7]、色譜法[8-9]等, 這些方法雖然能夠?qū)﹄p氧水實現(xiàn)靈敏的且選擇性的檢測, 但是這些方法大部分比較復(fù)雜, 耗時、耗力, 干擾因素多, 一般不適用于生物體內(nèi)快速、實時、原位定量對雙氧水進行檢測和分析。因此, 研究一種新的方法檢測雙氧水是十分必要的。近幾年發(fā)展起來的熒光探針法, 具有高選擇性和靈敏度, 非破壞性的分析和檢測系統(tǒng)易操作性等優(yōu)點, 在環(huán)境、化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用, 用于生物小分子檢測的熒光探針也受到了人們的廣泛關(guān)注[10-14]。因此, 本文合成了一種新型小分子熒光探針, 利用雙氧水和硼酸酯反應(yīng)脫去硼酸酯形成酚羥基的原理, 實現(xiàn)分子內(nèi)熒光開關(guān), 通過熒光強度與雙氧水濃度的關(guān)系, 實現(xiàn)對雙氧水的檢測。

1 儀器與試劑

實驗采用儀器為Varian INOVA-400型核磁共振儀(CDCl3為溶劑, TMS為內(nèi)標(biāo))、F-7000熒光光譜。實驗所用試劑二氯甲烷經(jīng)干燥處理后使用, 其他試劑均為市售分析純。

2 化合物合成

化合物的合成路線如圖1所示。

(1) 化合物1的合成。在100 mL的三頸燒瓶中, 加入鄰羥基苯乙酮(1.36 g, 10 mmol)、20 mL甲醇和20 mL 60%的氫氧化鈉水溶液, 冷卻到室溫, 然后再加入苯甲醛(1.06 g, 10 mmol)。室溫攪拌反應(yīng)12 h, 將反應(yīng)液倒入100 mL冰水中, 用濃鹽酸調(diào)至pH值為2, 析出粗品, 粗品用乙醇重結(jié)晶, 得化合物1, 淡黃色晶體1.59 g, 其產(chǎn)率71%。

(2) 化合物2的合成。在100 mL的三頸燒瓶中, 加入化合物1 (0.67 g, 3 mmol)、20 mL甲醇和4 mL 20%的氫氧化鈉水溶液, 冰浴, 然后再緩慢加入3 mL 30%的雙氧水溶液。滴加完后在室溫攪拌反應(yīng)8 h, 反應(yīng)液抽濾, 干燥, 得化合物2, 黃色固體0.7 g(未提純直接用于下一步反應(yīng))。1H NMR (500 MHz, CDCl3):8.27 (3 H, d,= 8.5 Hz),7.73 (1 H, m), 7.62 (1 H, d,= 8.5 Hz), 7.56 (2 H, t,= 8.0 Hz), 7.49 (1 H, t,= 8.5 Hz), 7.43 (1 H, t,= 7.5 Hz), 7.03 (1 H, s)。

(3) 化合物3的合成。在100 mL的三頸燒瓶中, 加入化合物2 (0.48 g, 2 mmol)、4–溴甲基苯硼酸頻哪酯(0.65 g, 2.2 mmol)、碳酸鉀(0.30 g, 2.2 mmol)和20 mL丙酮。合成路線見圖1。加熱回流12 h, 反應(yīng)液加水, 然后用乙酸乙酯萃取3次, 合并有機層, 用水、飽和食鹽水分別洗滌2次, 無水硫酸鎂干燥, 旋干, 經(jīng)柱層析, 洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯= 8∶1, 得化合物3, 白色固體0.59 g, 其產(chǎn)率65%。1H NMR (500 MHz, CDCl3):8.30 (1H, d,= 8.5 Hz),8.01 (2 H, q,= 8.5 Hz), 7.70 (3 H, d,= 8.0 Hz), 7.54 (1 H, d,= 8.5 Hz), 7.45 (4H, m), 7.31 (2 H, d,= 8.5 Hz), 5.18 (2 H, s), 1.35 (12 H, s)。MS:/= 455[M+H]+。

3 分析

3.1 探針的光譜性質(zhì)

為了進一步考察探針對不同濃度雙氧水的響應(yīng)性能, 在20 μM探針的乙腈-水(MeCN∶H2O＝1∶1,pH值為7.0)溶液中加入不同摩爾濃度的雙氧水, 測定其熒光光譜, 結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出, 在加入雙氧水之前, 探針在440 nm處有熒光, 加入雙氧水之后, 探針在543 nm處出現(xiàn)新的熒光, 并隨著雙氧水濃度的增大, 熒光強度在440 nm逐漸減弱, 543 nm處逐漸增強。這表明雙氧水與探針進行了反應(yīng)。

3.2 探針的選擇性

對于探針分子來說, 高選擇性是非常必要的。因此, 利用熒光光譜法測試了探針對物種的選擇性識別(圖2)。在20 μmol/L探針的乙腈-水溶液中分別加入雙氧水、叔丁基過氧化氫、硝基超氧根離子、次氯酸根、羥基自由基、Cu2+、Fe3+、Mg2+、NO3-、Br-, 在＝465 nm 激發(fā)下測定其熒光比值, 結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出, 當(dāng)雙氧水加入到探針的緩沖溶液中時, 體系熒光發(fā)生了顯著的變化, 而其他物種并不能引起探針熒光增強, 這也進一步說明該探針對雙氧水具有很好的選擇性。

圖2 探針對雙氧水響應(yīng)熒光光譜圖

3.3 pH值對探針的影響

為了獲得實驗的最佳檢測條件, 還考查了緩沖溶液的pH值對檢測雙氧水的影響。在固定探針的摩爾濃度為20 μmol/L, 雙氧水的摩爾濃度為50 μmol/L, 加入的 PBS對應(yīng)的pH值依次為1到12, 測得440/543, 如圖4所示。由圖4可以看出, 在一定條件下, 當(dāng)PBS的pH值為1～3時, 探針的熒光強度基本沒有變化, 當(dāng)PBS的pH值為4～7時, 熒光強度比值隨著pH值的增大而增強; 當(dāng)PBS的pH值為7～12時, 熒光強度比值不再變化。因此, 實驗中選擇pH值為7.0的緩沖溶液。

圖3 探針的選擇性

圖4 pH值對探針的影響

3.4 探針與雙氧水的反應(yīng)時間

為了進一步探討探針與雙氧水反應(yīng)的動力學(xué)關(guān)系, 研究了探針在乙腈-水(MeCN∶H2O＝1∶1, pH值為7.0)溶液中加入10當(dāng)量的雙氧水后的反應(yīng)時間曲線(圖5)。從圖5可看出, 當(dāng)沒有加入雙氧水時, 探針在440/543時不隨時間的增長而變化, 當(dāng)加入雙氧水后,440/543的比值發(fā)生了明顯的變化, 大約40 min時, 熒光比值達到最大。因此, 實驗過程中選擇反應(yīng)時間為40 min。

圖5 探針與雙氧水反應(yīng)的時間圖

4 結(jié)論

本文合成了一種新型用于雙氧水檢測的硼酸酯熒光探針, 其結(jié)構(gòu)用核磁共振光譜和質(zhì)譜進行了表征, 通過熒光光譜探討了其對雙氧水響應(yīng)的性能。結(jié)果表明, 該探針能夠?qū)﹄p氧水實現(xiàn)比率熒光檢測, 對雙氧水具有較好的選擇性, 同時能夠在生物環(huán)境中對雙氧水進行檢測, 為在生物體中對雙氧水實現(xiàn)實時、在線檢測提供了參考。

參考文獻：

[1] Thompson A M. The oxidizing capacity of the Earth’s atmosphere: Probable past and future changes [J]. Science, 1992, 256: 1 157-1 165.

[2] Fruehauf J P, Meyskens F L. Reactive oxygen species: a breath of life or death?[J].Clin Cancer Res, 2007, 13: 789-794.

[3] Ohshima H, Tatemichi M, Sawa T. Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis [J]. Arch Biochem Biophys, 2003, 417(1): 3-11.

[4] Mattson M P. Pathways towards and away from Alzheimer's disease [J]. Nature, 2004, 430: 631-639.

[5] Xu M, Bunes B R, Zang L. Paper-based vapor detection of hydrogen peroxide:colorimetric sensing with tunable interface [J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2011, 3: 642-647.

[6] Klassen N V, Marchington D, McGowan H C E. H2O2determination by the I3-method and by KMnO4titration [J]. Anal Chem, 1994, 66: 2 921-2 925.

[7] Yuan P X, Zhuo Y, Chai Y Q, et al. Dendritic silver/silicon dioxide nanocomposite modified electrodes for electro- chemical sensing of hydrogen peroxide [J]. Electroanalysis, 2008, 20: 1 839-1 844.

[8] Jia W Z, Guo M, Zheng Z, et al. Vertically aligned CuO nanowires based electrode for amperometric detection of hydrogen peroxide [J]. Electroanalysis, 2008, 20: 2 153-2 157.

[9] Oszwa?dowski S, Lipka R, Jarosz M. Simultaneous determination of zirconium and hafnium as ternary complexes with 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol and fluoride by reversed-phase liquid chromatography [J]. Anal Chim Acta, 1998, 361: 177-187

[10] Shu X H, Chen Y, Yuan H Y, et al. H2O2sensor based on the room-temperature phosphorescence of nano TiO2/SiO2composite [J]. Anal Chem, 2007, 79: 3 695-3 702.

[11] Lippert A R G C, Bittner V D, Chang C. Boronate oxidation as a bioorthogonal reaction approach for studying the chemistry of hydrogen peroxide in living systems [J]. J Acc Chem Res, 2011, 44: 793-804.

[12] Hitomi Y, Takeyasu T, Funabiki T, et al. Detection of enzymatically generated hydrogen peroxide by metal-based fluorescent probe [J]. Anal Chem, 2011, 83: 9 213-9 216.

[13] Sun X L, Xu S Y, Flower S E, et al. “Integrated” and “insulated” boronate-based fluorescent probes for the detection of hydrogen peroxide [J]. Chem Commun, 2013, 49: 8 311-8 313.

[14] Yu F B, Li P, Song P, et al. Facilitative functionalization of cyanine dye by an on-off-on fluorescent switch for imaging of H2O2oxidative stress and thiols reducing repair in cells and tissues [J]. Chem Commun, 2012, 48: 4 980-4 982.

(責(zé)任編校:劉曉霞)

Study on fluorescent probe for the detection of hydrogen peroxide based on borate ester

Huang Ya, Zhang Chunxiang, Yang Zhiquan, Deng Yan, Liang Min, Zhang Yu, Zheng Qingyun, Shen Youmin, Zhang Xiangyang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

A fluorescent probe is synthesized via aldol reaction, oxidative reaction, electrophilic substitution reaction from 2-hydroxyacetophenone and benzaldehyde. Its structure is characterized by1H NMR and MS. The spectroscopic properties, selectivity, pH-dependent, time response of the target probe with H2O2is investigated by the fluorescence spectrophotometry. The results show the probe can detect H2O2.

fluorescent probe; H2O2; Borate ester; synthesis; characterization

10.3969/j.issn.1672–6146.2015.03.007

O 657.3

1672–6146(2015)03–0026–07

張春香, cxzhang81@163.com; 黃雅, 1633848427@qq.com。

2015-05-15

材料科學(xué)與工程湖南省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目(15YCYB02); 湖南文理學(xué)院科學(xué)研究項目(14YB05); 湖南省十二五重點建設(shè)學(xué)科—應(yīng)用化學(xué)資助; 湖南文理學(xué)院芙蓉學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目; 湖南文理學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目。