史自濤 姚焰礎(chǔ) 江 山 肖 融 劉作華楊飛云 董國忠 郭致君

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，榮昌 402460;2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北碚 400715;3.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100081)

斷奶可造成仔豬心理、飼糧、環(huán)境等應(yīng)激，極 易引起斷奶應(yīng)激綜合征，導(dǎo)致仔豬腸道菌群失調(diào)、采食量下降、生長緩慢、腹瀉甚至死亡，經(jīng)濟(jì)損失因而較大。因此，確保仔豬順利斷奶對提高養(yǎng)豬效益具有重要的意義。抗生素具有顯著的抗病、抗應(yīng)激和促生長效果，在斷奶仔豬以及生長育肥豬飼養(yǎng)過程中被廣泛應(yīng)用［1］。但是，抗生素殘留、細(xì)菌耐藥性增加、長期使用導(dǎo)致畜禽免疫力降低以及引起畜禽二次感染等問題，也引起了人們極大的關(guān)注［2］，因此，尋找抗生素替代品便成為現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。益生菌是可以通過改善腸道微生態(tài)區(qū)系而對動(dòng)物產(chǎn)生有益影響的活的微生物添加劑［3］，有研究表明，益生菌是一種理想的抗生素替代品［4］。糞腸球菌是乳酸菌的一種，是存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的一種兼性厭氧革蘭氏陽性菌，農(nóng)業(yè)部在2008年公布的第1126號公告顯示，我國允許在飼料中添加的益生菌種類達(dá)到16種，其中包括糞腸球菌。近年來，糞腸球菌在斷奶仔豬飼糧中的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道，其添加量及效果也不盡相同，且其能否替代抗生素應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧的研究也未見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)通過在斷奶仔豬飼糧中添加不同水平的糞腸球菌，研究其替代抗生素對斷奶仔豬生長性能、腹瀉指數(shù)及腹瀉率、血液生化指標(biāo)及免疫器官的影響，為糞腸球菌在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糞腸球菌:糞腸球菌凍干菌粉(1.0×1010CFU/g)，由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

抗生素:硫酸黏菌素和桿菌肽鋅購自江蘇天成保健品有限公司，其純度均為10%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

選用(28±2)日齡平均體重為(7.60±0.81)kg的“杜×長×大”斷奶仔豬120頭，隨機(jī)分為5個(gè)組，每個(gè)組6個(gè)重復(fù)(公母各占1/2)，每重復(fù)4頭，每個(gè)重復(fù)為1圈。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加100 mg/kg硫酸黏菌素和400 mg/kg桿菌肽鋅，3個(gè)糞腸球菌組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加40、200和1 000 mg/kg糞腸球菌(飼糧中實(shí)際所含的糞腸球菌水平分別為4×105、2×106、1×107CFU/g)?；A(chǔ)飼糧參照 NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutritent levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)在重慶市畜牧科學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)研究所試驗(yàn)豬場進(jìn)行，所有仔豬在封閉式豬舍中飼養(yǎng)，水泥地面，自由采食和飲水，驅(qū)蟲、消毒及免疫均按豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行，試驗(yàn)期31 d。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 生長性能

試驗(yàn)全程以圈為單位記錄采食量，第1、15和32天08:00對每頭仔豬空腹稱重，計(jì)算1～14 d、15～31 d及1～31 d的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。

1.4.2 腹瀉指數(shù)及腹瀉率

試驗(yàn)期內(nèi)每天09:00和15:00分別觀察仔豬糞便，按照 Marquardt等［5］的方法對糞便進(jìn)行評分。0分:糞便條形或粒狀;1分:軟糞、能成形;2分:稠裝、不成形、糞水未分離;3分:液狀、不成形、糞水分離。當(dāng)糞便評分為2或以上時(shí)認(rèn)為仔豬發(fā)生腹瀉。計(jì)算1～14 d、15～31 d及1～31 d的腹瀉指數(shù)和腹瀉率。

1.4.3 血液生化指標(biāo)

在試驗(yàn)期第32天08:00，每個(gè)組每個(gè)重復(fù)選1頭接近平均體重的仔豬，空腹前腔靜脈采血5 mL于抗凝管中，采用CX4 Pro全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter公司，美國)測定血液中葡萄糖、總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、總膽固醇和尿素氮含量以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活性。計(jì)算白蛋白/球蛋白(A/G，簡稱白球比)。

1.4.4 免疫器官的測定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)組每個(gè)重復(fù)選1頭接近平均體重的仔豬屠宰，切開腹腔取肝臟和脾臟，去除結(jié)締組織稱取濕重，并計(jì)算其器官指數(shù)。

器官指數(shù)(g/kg)=器官濕重/活體重。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

先用Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，再通過SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以 P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，在1～14 d，飼糧中添加抗生素和糞腸球菌對斷奶仔豬的ADFI和ADG無顯著影響(P＞0.05)。在15～31 d，與對照組和抗生素組相比，200和1 000 mg/kg組均可極顯著提高ADFI和 ADG(P＜0.01)。在 1 ～31 d，與對照組相比，200和1 000 mg/kg組的ADFI均極顯著提高(P＜0.01)，而ADG分別顯著和極顯著增加(P＜0.05 和 P＜0.01);與抗生素組相比，1 000 mg/kg組可極顯著提高 ADFI(P＜0.01)，200和 1 000 mg/kg組的ADG分別顯著和極顯著增加(P＜0.05 和 P＜0.01)。

2.2 糞腸球菌對斷奶仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響

由表3可知，在1～14 d，與對照組相比，40 mg/kg組可以顯著降低斷奶仔豬的腹瀉指數(shù)和腹瀉率(P＜0.05)。在 15～31 d和 1～31 d，飼糧中添加抗生素和糞腸球菌對腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響差異不顯著(P＞0.05)，但40和1 000 mg/kg組均可以在一定程度上降低15～31 d及1～31 d的腹瀉率，其中15～31 d腹瀉率分別比對照組降低了29.85%和33.92%，1～31 d腹瀉率分別比對照組降低了47.50%和28.80%。

2.3 糞腸球菌對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加抗生素對斷奶仔豬血液中總蛋白和球蛋白含量無顯著影響(P＞0.05)，而糞腸球菌可以顯著提高血液中總蛋白含量(P＜0.05)，其中添加量為 200和1 000 mg/kg時(shí)達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，且這2組分別可以顯著和極顯著提高血液中球蛋白含量(P＜0.05 和 P＜0.01);與抗生素組相比，200 和1 000 mg/kg組的總蛋白含量也均顯著提高(P＜0.05)。與對照組相比，抗生素組和1 000 mg/kg組白球比顯著降低(P＜0.05)，而抗生素組血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低(P＜0.05)，200 mg/kg組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低(P＜0.05)，糞腸球菌對谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著影響(P＞0.05)?？股睾图S腸球菌對血液中尿素氮、甘油三酯、葡萄糖含量以及乳酸脫氫酶活性影響均不顯著(P＞0.05)。

2.4 糞腸球菌對斷奶仔豬免疫器官的影響

由表5可知，飼糧中添加抗生素和糞腸球菌對斷奶仔豬脾臟重量和肝臟指數(shù)無顯著影響(P＞0.05)，1 000 mg/kg組肝臟重量和脾臟指數(shù)可一定程度上提高(P＞0.05)，分別比對照組提高10.92%和 19.70%。與抗生素組相比，200和1 000 mg/kg組可顯著提高肝臟重量(P＜0.05)。

表2 糞腸球菌對斷奶仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of Enterococcus faecalis on growth performance of weaner piglets

表3 糞腸球菌對斷奶仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響Table 3 Effects of Enterococcus faecalis on diarrhea index and diarrhea rate of weaner piglets

3 討論

3.1 糞腸球菌對斷奶仔豬生長性能的影響

腸道中的益生菌可以與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生有機(jī)酸及抑菌成分，抑制病原菌的生長，優(yōu)化腸道微生態(tài)區(qū)系，改善腸道健康，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，從而達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長的目的［6-7］。糞腸球菌是益生菌的一種，侯璐［8］的研究表明，糞腸球菌具有耐酸、耐膽鹽以及耐高溫等特性，能夠順利到達(dá)畜禽腸道并存活，Hugas等［9］指出，糞腸球菌可產(chǎn)生有機(jī)酸及細(xì)菌素，抑制腸道內(nèi)病原菌及腐敗微生物的生長，降低盲腸及回腸pH，從而優(yōu)化腸道環(huán)境。

表4 糞腸球菌對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of Enterococcus faecalis on blood biochemical parameters of weaner piglets

表5 糞腸球菌對斷奶仔豬免疫器官的影響Table 5 Effects of Enterococcus faecalis on immune organs of weaner piglets

目前，關(guān)于糞腸球菌對斷奶仔豬生長性能影響的報(bào)道效果不一。劉輝等［10］在斷奶仔豬飼糧中添加糞腸球菌發(fā)現(xiàn)，ADG提高了8.79%，F(xiàn)/G降低了8.43%，差異顯著。侯璐［8］在斷奶仔豬飼糧中添加糞腸球菌發(fā)現(xiàn)，ADG提高了8.51%，F(xiàn)/G降低了7.57%，但差異不顯著。而Ross等［11］在斷奶仔豬飼糧中添加糞腸球菌之后，仔豬采食量會(huì)顯著降低而飼料利用率顯著提高。本試驗(yàn)1～14 d，糞腸球菌對斷奶仔豬生長性能影響不顯著。Estienne等［12］指出，斷奶后2周是仔豬適應(yīng)斷奶的關(guān)鍵時(shí)期，也是仔豬腸道微生態(tài)區(qū)系最脆弱的時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期使用乳酸菌其效果最好。本試驗(yàn)1～14 d結(jié)果與上述結(jié)論不符，表明糞腸球菌添加量為1 000 mg/kg時(shí)還不足以體現(xiàn)出其益生作用，提示仔豬在斷奶后2周對糞腸球菌的需要量可能更大。在15～31 d，飼糧中糞腸球菌添加量為40 mg/kg(飼糧中實(shí)際所含糞腸球菌水平為4×105CFU/g)時(shí)對斷奶仔豬生長性能影響不顯著，而添加量為200和1 000 mg/kg(飼糧中實(shí)際所含糞腸球菌水平分別為2×106和1×107CFU/g)時(shí)，ADFI和ADG均極顯著提高，且后者效果優(yōu)于前者。Gardiner等［13］指出，飼糧中益生菌的最低添加量應(yīng)達(dá)到 1×106CFU/g，并且 Guerra等［14］進(jìn)一步指出，在一定的添加范圍內(nèi)，生長性能會(huì)隨著益生菌添加量的提高而進(jìn)一步改善，本試驗(yàn)15～31 d的結(jié)果與上述結(jié)論一致。

3.2 糞腸球菌對斷奶仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響

在斷奶過程中，仔豬受到心理、飼糧以及環(huán)境等應(yīng)激時(shí)極易引起腸道微生態(tài)區(qū)系紊亂，導(dǎo)致有害菌大量繁殖，從而引起腹瀉的發(fā)生。Fairbrother等［15］指出，斷奶后腸道中大量增殖的大腸桿菌是引起腹瀉的主要病原菌，Sandine［16］也指出，腹瀉動(dòng)物糞便中大腸桿菌數(shù)量要明顯高于乳酸桿菌。有研究表明，益生菌可以增殖有益菌，抑制有害菌的繁殖，從而降低腹瀉的發(fā)生。Larsen等［17］在斷奶仔豬飼糧中添加芽孢桿菌后，仔豬腹瀉率顯著降低，他還指出，仔豬回腸和糞便中大腸桿菌數(shù)量顯著降低、回腸中乳酸菌數(shù)量顯著升高，芽孢桿菌對腸道微生態(tài)環(huán)境的改善是腹瀉率降低的主要原因。同樣，Mallo等［18］在斷奶仔豬飼糧中添加屎腸球菌的研究也得到相似的結(jié)論。本試驗(yàn)1～14 d，糞腸球菌40 mg/kg組可以顯著降低腹瀉指數(shù)和腹瀉率，在15～31 d及1～31 d，糞腸球菌40和1 000 mg/kg組均可以在一定程度上降低腹瀉率。糞腸球菌可以產(chǎn)生有機(jī)酸和細(xì)菌素，抑制大腸桿菌的生長［9］，劉輝等［10］和侯璐［8］均指出，糞腸球菌可顯著降低斷奶仔豬糞便中大腸桿菌數(shù)量，顯著增加糞便中乳酸菌數(shù)量，因此，本研究中糞腸球菌對腹瀉的改善作用可能與其對大腸桿菌的抑制有關(guān)，其具體原因需進(jìn)一步探究。另外，辛娜等［19］指出，當(dāng)過量外源微生物進(jìn)入腸道后，會(huì)與腸道內(nèi)正常菌群爭奪營養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)，在一定程度上擾亂腸道內(nèi)正常微生態(tài)區(qū)系的穩(wěn)定，這可能是本試驗(yàn)中糞腸球菌添加量為200和1 000 mg/kg時(shí)對腹瀉的改善效果不如40 mg/kg顯著的原因。在試驗(yàn)的1～14 d、15～31 d和1～31 d，糞腸球菌40和1 000 mg/kg組對仔豬腹瀉的抑制作用均優(yōu)于抗生素組，因此，糞腸球菌可以替代抗生素用來預(yù)防仔豬腹瀉。

3.3 糞腸球菌對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

血液是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境重要的組成部分，血液中生理生化指標(biāo)的改變可反映動(dòng)物機(jī)體或器官的代謝和健康狀況?？偟鞍子砂椎鞍缀颓虻鞍捉M成，血液中其含量可反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝狀況。白蛋白由肝臟合成，是機(jī)體蛋白質(zhì)的主要來源之一，而球蛋白由B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞后分泌產(chǎn)生，血液中抗體水平增加時(shí)球蛋白含量也會(huì)隨之增加，其可反映機(jī)體的免疫水平。白球比可反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，白球比降低表明球蛋白的合成增加，說明機(jī)體免疫機(jī)能提高［20-21］。本試驗(yàn)中，糞腸球菌可顯著(40 mg/kg組)或極顯著(200和1 000 mg/kg組)提高血液中總蛋白含量，糞腸球菌200和1 000 mg/kg組的球蛋白含量也分別顯著和極顯著增加，1 000 mg/kg組的白球比顯著降低，而抗生素對總蛋白、白蛋白、球蛋白含量以及白球比影響均不顯著，這表明糞腸球菌可替代抗生素，改善仔豬機(jī)體蛋白質(zhì)代謝，提高仔豬免疫力。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要分布于動(dòng)物肝細(xì)胞及其他組織細(xì)胞內(nèi)，正常情況下這2種酶在血液中活性很低，但是當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，這2種酶會(huì)進(jìn)入血液中，因此，血液中這2種酶活性可反映肝臟功能狀況［22］。本試驗(yàn)中，抗生素可顯著降低血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，而糞腸球菌200 mg/kg組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低，表明糞腸球菌對仔豬肝臟功能具有一定的保護(hù)作用。

乳酸脫氫酶存在于機(jī)體各組織器官中，是參與糖酵解的一種重要的酶，與血液葡萄糖含量一樣，血液中乳酸脫氫酶活性可反映機(jī)體糖代謝狀況。血液中尿素氮含量可反映機(jī)體氨基酸平衡狀況，血液甘油三酯和總膽固醇含量是檢測體脂代謝狀況的重要指標(biāo)［23-24］。本試驗(yàn)中，抗生素和糞腸球菌對血液中這幾個(gè)指標(biāo)影響均不顯著，表明糞腸球菌對機(jī)體糖代謝、氨基酸平衡以及脂肪代謝均無負(fù)面影響。

3.4 糞腸球菌對斷奶仔豬免疫器官的影響

肝臟是動(dòng)物體內(nèi)新陳代謝最旺盛的代謝器官，還擔(dān)負(fù)著一定的免疫功能。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，是各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分化、成熟、定居以及進(jìn)行免疫應(yīng)答的主要場所［25］。器官指數(shù)是試驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)指標(biāo)之一，其大小可在一定程度上反映機(jī)體器官功能的強(qiáng)弱［26］。關(guān)于益生菌對斷奶仔豬免疫器官影響的報(bào)道很多，但效果各異。王永等［27］在斷奶仔豬飼糧中添加屎腸球菌發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌對肝臟指數(shù)影響不顯著，但可顯著提高脾臟重量和脾臟指數(shù)，從而促進(jìn)脾臟的發(fā)育。辛娜等［28］指出，芽孢桿菌對斷奶仔豬的肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)以及脾臟指數(shù)影響不顯著，但具有增大免疫器官指數(shù)的趨勢，而周盟等［29］則指出，斷奶仔豬免疫器官的發(fā)育不受益生菌的影響。上述研究結(jié)果的不同可能與試驗(yàn)動(dòng)物品種、菌種、加工貯存條件、添加劑量以及試驗(yàn)環(huán)境等有關(guān)。到目前為止，還沒有關(guān)于糞腸球菌對斷奶仔豬免疫器官影響的報(bào)道。本試驗(yàn)中，1 000 mg/kg組肝臟重量和脾臟指數(shù)可一定程度的提高;與抗生素組相比，200和1 000 mg/kg組均可顯著提高肝臟重量，表明糞腸球菌可以在一定程度上促進(jìn)斷奶仔豬肝臟和脾臟的發(fā)育，改善其免疫功能。分析其原因，可能是由于糞腸球菌自身作為一種抗原物質(zhì)，可以有效的刺激肝臟和脾臟的生長發(fā)育，另外，糞腸球菌在斷奶仔豬腸道中生長繁殖，合成的一些有益成分可能也會(huì)對肝臟和脾臟的發(fā)育產(chǎn)生一定的刺激作用，其具體原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

①飼糧中添加糞腸球菌可提高15～31 d的ADFI和ADG，改善斷奶仔豬的生長性能。另外，糞腸球菌可降低仔豬腹瀉率，且效果優(yōu)于抗生素。

②飼糧中添加糞腸球菌可提高血液中總蛋白和球蛋白含量，降低白球比以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，對肝臟和脾臟發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，可以改善仔豬機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和免疫功能，緩解斷奶應(yīng)激對仔豬的負(fù)面影響。

③綜合本試驗(yàn)結(jié)果，糞腸球菌可替代抗生素而應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧中，且添加量為1 000 mg/kg時(shí)的效果最好。

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