王斯佳 蔡輝益 劉國華 閆海潔

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，家禽營養(yǎng)與飼料研究室，北京 100081)

膽堿(choline)是一種水溶性季銨鹽，具有強(qiáng)堿性。自發(fā)現(xiàn)以來，已有一百五六十年的歷史。早在80年前，膽堿的營養(yǎng)作用就已確立。營養(yǎng)學(xué)中將其歸為B族維生素類，但機(jī)體對(duì)膽堿的需要量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他維生素。膽堿是機(jī)體內(nèi)許多生理功能所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。膽堿及其代謝產(chǎn)物對(duì)于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、甲基化反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)、膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及脂質(zhì)膽固醇的運(yùn)輸和代謝都至關(guān)重要［1］。當(dāng)膽堿不足或者缺乏時(shí)，將誘發(fā)脂肪肝，機(jī)體生長明顯減慢，飼料的利用效率明顯下降。在畜禽生產(chǎn)中，膽堿最主要的功能即作為甲基供體。膽堿被氧化過程中釋放出來的甲基基團(tuán)，是合成蛋氨酸、磷脂、肌酸、肉堿、腎上腺素、核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)等具有重要生理作用的物質(zhì)所必需的，在神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中所起的作用不容忽視［2］。通常認(rèn)為，生長期和成年期動(dòng)物都需要提供甲基。但肉仔雞一般對(duì)膽堿的需求量較高，體內(nèi)甲基的合成量非常有限，利用蛋氨酸和甜菜堿來合成膽堿的能力很弱，必須通過外源性添加才能滿足其生長需要。

氯化膽堿(2－羥乙基－三甲胺)是膽堿的中性化合物，易溶于水和乙醇，溶液呈弱酸性，熱穩(wěn)定性好［3］。在飼料工業(yè)生產(chǎn)上，膽堿通常是以氯化膽堿的形式以水溶液直接添加或以載體吸附添加于飼料中。氯化膽堿被認(rèn)為是膽堿最經(jīng)濟(jì)有效的來源。雖然氯化膽堿在包括人類在內(nèi)的所有動(dòng)物中已被允許作為添加劑使用，但由于飼糧結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性和試驗(yàn)數(shù)據(jù)有限，目前仍未規(guī)定最大添加劑量。但是，膽堿過量造成動(dòng)物生產(chǎn)性能受阻的報(bào)道屢見不鮮，過量的氯化膽堿也會(huì)導(dǎo)致人產(chǎn)生頭暈惡心的癥狀。歐洲食品安全機(jī)構(gòu)(EFSA)2011年發(fā)表聲明:當(dāng)前認(rèn)為商業(yè)飼料中氯化膽堿的使用量對(duì)于動(dòng)物來說是安全的，但與使用量相比，家禽的安全范圍較?。?］。在集約化的生產(chǎn)條件下，在追求利益最大化的今天，氯化膽堿被大量甚至過量添加，這不僅會(huì)帶來生產(chǎn)成本的浪費(fèi)，也勢(shì)必增加了動(dòng)物機(jī)體的負(fù)擔(dān)。如果缺乏對(duì)肉雞體內(nèi)膽堿吸收代謝規(guī)律的認(rèn)識(shí)，就無法實(shí)現(xiàn)膽堿的安全有效利用。目前，關(guān)于膽堿在肉雞體內(nèi)吸收、分布和代謝的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用藥代動(dòng)力學(xué)的方法，通過研究膽堿在肉雞血液中的代謝和分布，旨在探討飼糧中膽堿添加量與動(dòng)物機(jī)體吸收利用的關(guān)系，以期為膽堿的合理使用提供理論依據(jù)，并為研究營養(yǎng)物質(zhì)代謝提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物及儀器

ICS－3000離子色譜系統(tǒng)(美國 Dionex公司)，電導(dǎo)檢測(cè)器;自動(dòng)進(jìn)樣器及Chromeleon色譜數(shù)據(jù)處理工作站;MiliQ－Element純水機(jī)(法國Millipore);KQ－500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);冷凍干燥機(jī)(FD－1B－50，北京博醫(yī)康公司);電熱恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠);0.22μm尼龍濾膜。

膽堿酒石酸氫鹽(純度98.0%，日本TCI試劑);MiliQ－Element超純水;鹽酸(優(yōu)級(jí)純，北京化工廠);曲拉通X－100(化學(xué)純，西隴化工股份有限公司);甲烷磺酸(色譜純，Sigma公司)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

12只經(jīng)正常免疫程序后的9周齡健康愛拔益加(AA)肉公雞，體重為(4.0±0.57)kg。試驗(yàn)雞隨機(jī)分為3組，每組4只?？刂茰囟葹?4℃，相對(duì)濕度為55% ～70%。試驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)1周，飼喂缺乏膽堿的純合飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)雞自由采食和飲水。口服標(biāo)準(zhǔn)氯化膽堿前禁食48 h，正常飲水。灌藥前停止飲水，灌藥后2 h進(jìn)水，藥代試驗(yàn)期間全程饑餓。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥

12只試驗(yàn)雞分為 A、B、C 3組，每組4只，A組為空白對(duì)照組，B為200 mg/kg劑量組，C組為400 mg/kg劑量組(劑量均以膽堿計(jì))。給藥前空腹稱重。根據(jù)試驗(yàn)雞體重，分別按目標(biāo)膽堿劑量換算為氯化膽堿量后，準(zhǔn)確稱取氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品，均勻混入40 g無膽堿飼糧中，一次性灌喂?？瞻讓?duì)照組灌喂相應(yīng)質(zhì)量的無膽堿飼糧?？诜┝康拇_定方法如下:參見NRC(1994)肉雞后期需要量為750 mg/kg，以9周齡肉公雞每只每日采食飼糧0.25 kg 計(jì)，750 mg/kg×0.25 kg=187.5 mg≈200 mg。普遍認(rèn)為雞的膽堿最大耐受限量為需要量的2倍［5］，故本試驗(yàn)設(shè)定了一個(gè)正常劑量組和一個(gè)最大耐受劑量組進(jìn)行研究。

1.2.2 采樣

試驗(yàn)雞仰臥并人工保定，固定一側(cè)翅膀，拔去翼下羽毛，消毒皮膚，從翼下靜脈采血。于給藥前采 1 次血，給藥后分別于 1、2、3、4、8、12、24、36 和48 h采血于肝素抗凝管中，每次采血1.5～2.0 mL，－20℃冰箱保存。

1.2.3 樣品處理

樣品于－96℃冷凍干燥72 h并回潮，研缽研磨制樣。準(zhǔn)確稱取約0.2 g凍干樣品于50 mL具塞玻璃錐形瓶中，加入27.5 mL 1.0%的曲拉通－X100溶液，超聲15 min，再加入1.5 mL鹽酸，加蓋，混勻。將錐形瓶放入70℃水浴3 h，每小時(shí)搖1次。將水解產(chǎn)物冷卻至室溫，用水沖洗錐形瓶，所得溶液過濾至容量瓶中，將濾液定容至100 mL，此濾液可以在4℃下保存3 d。分析前用水繼續(xù)稀釋此濾液10倍后，過0.22μm尼龍濾膜。同時(shí)準(zhǔn)備試劑空白。

1.2.4 色譜條件

色譜柱:陽離子交換分離柱，包括IonPac CS12分析柱(250 mm×4 mm)和CG12保護(hù)柱(50 mm×4 mm);淋洗液:甲烷磺酸(16 mmol/L);抑制器:CSRS 300 4 mm，外接水。進(jìn)樣體積:100 uL。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

依照樣品制備的方法配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)參照品，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。膽堿標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果見表2和圖1。以電導(dǎo)率(y)對(duì)膽堿濃度(x)進(jìn)行線性回歸，方程為y=0.138 8x，相關(guān)系數(shù)(R2)=0.999 4。

表2 膽堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度與電導(dǎo)率的關(guān)系Table 2 Relationship between concentration of standard choline and conductivity

圖1 膽堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度與電導(dǎo)率的關(guān)系Fig.1 Relationship between concentration of standard choline and conductivity

1.2.6 精密度和回收率檢測(cè)

選擇膽堿含量較低的2個(gè)全血樣品進(jìn)行了2個(gè)水平加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)，結(jié)果見表3。實(shí)際樣品在該檢測(cè)條件下，目標(biāo)化合物膽堿的周圍無雜峰，能準(zhǔn)確定量，色譜分離圖見圖2。同時(shí)參照GB/T 5413.20—1997《嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測(cè)定》［6］的方法對(duì)血樣進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用非房室模型，通過在口服氯化膽堿后各取血點(diǎn)膽堿水平減去自身0點(diǎn)膽堿背景值所得膽堿濃度，達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(Tmax)均采用實(shí)測(cè)值，血藥濃度－時(shí)間曲線下面積(AUC)用梯形法計(jì)算，使用Winnolin 5.2軟件計(jì)算氯化膽堿的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)［血漿濃度第一時(shí)間曲線下面積(AUMC)、表觀分布容積(Vz/F)、半衰期(t1/2)、表觀清除率(CL/F)、平均駐留時(shí)間(MRT)、末端相的血藥濃度消除速率常數(shù)(Ke)］。使用SPSS 16.0軟件單因素方差分析(one-way ANOVA)方法對(duì)各組膽堿濃度進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)差異顯著時(shí)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 3 Spiked recovery test(n=6)

圖2 實(shí)際樣品中膽堿的離子色譜分離圖Fig.2 Choline analysis by ion chromatography in the actual sample

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度及藥－時(shí)曲線

各組單次口服不同劑量氯化膽堿后各時(shí)間點(diǎn)的膽堿濃度見表4?？瞻讓?duì)照組各采樣時(shí)間點(diǎn)的血液中膽堿濃度差異不顯著(P＞0.05);試驗(yàn)組由于采樣時(shí)間的不同，血液膽堿濃度有顯著差異(P＜0.05)。200 mg劑量組服藥8 h的膽堿水平顯著高于2、3、12 和 24 h(P＜0.05)，且極顯著高于服藥前(0 h)和服藥后 1、36、48 h(P＜0.01);400 mg劑量組服藥8 h的膽堿水平顯著高于3、4、12和24 h(P＜0.05)，且極顯著高于其余各時(shí)間點(diǎn)(P＜0.01)。200 mg試驗(yàn)組口服氯化膽堿后 3、4、8 h的血液膽堿濃度顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，400 mg劑量組在口服后第 3、4、8、12 h的膽堿濃度顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，但2個(gè)試驗(yàn)組間無顯著差異(P＞0.05)，口服前及口服后其他時(shí)間點(diǎn)，各組間差異不顯著(P＞0.05)。

平均藥－時(shí)曲線見圖3。2個(gè)劑量組均在服藥后8 h吸收達(dá)到最高峰，吸收相和消除相中，2個(gè)劑量組血藥濃度與采樣時(shí)間均呈線性相關(guān)和指數(shù)相關(guān)，且R2均達(dá)0.9以上，見圖4、圖5。

2.2 氯化膽堿非房室模型的藥代動(dòng)力學(xué)研究

肉雞給予氯化膽堿形式的膽堿200和400 mg/kg后，非房室模型的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表5。2個(gè)劑量組都在口服氯化膽堿8 h后血漿膽堿濃度達(dá)到最高水平;二者的半衰期分別為7.60和9.91 h，200 和 400 mg/kg 的 AUMC 分別為5 979.06和10 899.78 mg/(kg·h)，400 mg 劑量組比200 mg劑量組提高了近1倍;對(duì)2個(gè)劑量組的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)，除Vz/F和CL/F差異極顯著(P＜0.01)外，其余參數(shù)均無顯著性差異(P＞0.05)。

表4 膽堿缺乏飼糧飼喂肉仔雞全血中的膽堿濃度Table 4 The content of choline in the blood of broilers fed choline-deficiency diet

圖3 健康肉雞口服200和400 mg/kg氯化膽堿后血藥濃度－時(shí)間曲線Fig.3 The concentration-time curve after oral administration 200 and 400 mg/kg of choline chloride in healthy subjects(n=4)

圖4 肉雞口服不同劑量氯化膽堿吸收相血藥濃度－時(shí)間曲線Fig.4 The concentration-time curve in absorption phase of different-dose choline chloride in broiler by oral administration

圖5 肉雞口服200和400 mg/kg氯化膽堿消除相血藥濃度－時(shí)間曲線Fig.5 The concentration-time curve in elimination phase of 200 and 400 mg/kg of choline chloride in broiler by oral administration

3 討論

3.1 離子色譜法測(cè)定血液中膽堿的可行性

膽堿是一種含氮的有機(jī)堿性化合物，在化學(xué)上的名稱為(β羥乙基)三甲基氨的氫氧化物，其分子結(jié)構(gòu)式為HOCH2CH2N+(CH3)3，相對(duì)分子質(zhì)量121.18。由于其在水溶液中可完全電離，堿性強(qiáng)度類似于氫氧化鈉，故可以選擇離子色譜法，采用陽離子交換柱進(jìn)行測(cè)定［7］。離子色譜法被認(rèn)為是測(cè)定飼料和食品中膽堿含量的主要方法。關(guān)于飼料和嬰兒奶粉中膽堿含量的研究方法已經(jīng)比較成熟，從膽堿含量的檢測(cè)到摻假的鑒別都已見文獻(xiàn)報(bào)道［8－12］。目前預(yù)混料中氯化膽堿測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) GB/T 17481—2008［13］和飼料級(jí)氯化膽堿測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HG/T 2941—2004［14］中都是以離子色譜法作為仲裁法的，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5413.20—1997［6］中，測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中膽堿含量也推薦使用離子色譜法。文獻(xiàn)中的檢測(cè)對(duì)象一般為固體，前處理較為簡便。而本試驗(yàn)中的檢測(cè)對(duì)象為血液樣品，其中有大量細(xì)胞懸浮，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)結(jié)果不穩(wěn)定。所以本試驗(yàn)采用冷凍干燥后研磨，并用鹽酸加熱后超聲浸提的方法，使樣品的細(xì)胞破碎，達(dá)到充分提取的效果。提取時(shí)加入的曲拉通－X100溶液可增加血液樣本的表面活性，使提取的溶液更加均一穩(wěn)定。經(jīng)檢驗(yàn)，本試驗(yàn)所采用的測(cè)定方法靈敏、快捷，效果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，且對(duì)其他干擾離子的分離效果良好。大大提高了對(duì)血液中膽堿檢測(cè)的精密度，回收率較高，可用于血液膽堿濃度測(cè)定和藥代動(dòng)力學(xué)研究。本試驗(yàn)中，從空白血液中可檢測(cè)到一定量的膽堿，本方法所測(cè)得的濃度數(shù)據(jù)為內(nèi)源性膽堿及給藥后暴露于血液中的膽堿之和。且本試驗(yàn)已證明，肉雞體內(nèi)內(nèi)源性膽堿的合成比較穩(wěn)定，故口服氯化膽堿組的各時(shí)間點(diǎn)膽堿濃度減去自身0點(diǎn)的膽堿背景值所得膽堿水平，可反映氯化膽堿在肉雞體內(nèi)的代謝規(guī)律。

表5 健康肉雞口服200和400 mg/kg氯化膽堿的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 The main pharmacokinetic parameters after oral administration 200 and 400 mg/kg of choline chloride in healthy subjects(n=4)

3.2 膽堿的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)藥代學(xué)參數(shù)的影響

血漿中的膽堿來源主要為:飼糧膽堿、磷脂分子的分解產(chǎn)物以及肝臟等器官的內(nèi)源合成。肝臟是膽堿內(nèi)源合成的主要場所［15－16］，小腦也可以合成少量的膽堿［17］。體內(nèi)的膽堿大多以磷脂酰膽堿(PC)的形式存在于細(xì)胞膜中，也有少部分以鞘磷脂(SM)和溶血磷脂酰膽堿(Lyso-PC)的形式存在，Lyso-PC再次形成PC后，吸收進(jìn)入淋巴循環(huán)，并最終進(jìn)入血液。膽堿是血漿的常規(guī)成分［18］，紅細(xì)胞有主動(dòng)積累膽堿的功能，血液中的膽堿也主要集中于此［19］。在人類醫(yī)學(xué)上，膽堿作為多種病理狀態(tài)下的生物標(biāo)志，血漿或全血中膽堿濃度的上升對(duì)于心臟疾病的預(yù)測(cè)意義重大。血漿膽堿濃度也可以作為飼糧膽堿水平的反映指標(biāo)。大量研究表明，血漿游離膽堿濃度會(huì)隨著飼糧中膽堿水平的變化迅速上升或下降［20－23］。本研究采用非房室模型，研究膽堿在肉雞血液中的吸收代謝規(guī)律發(fā)現(xiàn):9周齡健康肉雞血液中內(nèi)源性膽堿的合成較穩(wěn)定，口服氯化膽堿可改變血液中膽堿的濃度;膽堿在肉雞體內(nèi)的吸收較為迅速，200和400 mg/kg劑量組血藥濃度都在口服氯化膽堿8 h后達(dá)到峰值;t1/2分別為7.60和 9.91 h，證明膽堿在肉雞體內(nèi)代謝較快;Vz/F分別為876.99和318.43 L/kg，表明膽堿對(duì)組織穿透力強(qiáng)，在組織內(nèi)濃度較高，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的分布廣泛，而且當(dāng)膽堿濃度較低時(shí)，機(jī)體更容易利用;CL/F分別為83.27和21.22 mg/(kg·h)，表明當(dāng)膽堿劑量較低時(shí)，血液中的膽堿代謝更迅速，更有利于膽堿被機(jī)體利用;2 組的 Cmax分別為 399.88 和 445.88 mg/kg，雖二者之間無顯著差異，但膽堿攝入量高時(shí)血中膽堿水平有升高趨勢(shì);AUMC分別為 5 979.06和10 899.78 mg/(kg·h)，劑量提高 1 倍，AUMC 提高了0.82%，提示過量的膽堿進(jìn)入血液后，并未完全被機(jī)體吸收。

膽堿在血液中的壽命、在體內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)入胞都是膽堿代謝途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［24］。飼糧膽堿在進(jìn)入腸道前即被分解代謝，未被分解的游離膽堿在整個(gè)小腸都可被吸收，后隨血液運(yùn)送至全身［25－26］。膽堿吸收入血后，隨血液分布至全身后進(jìn)入代謝環(huán)節(jié)。膽堿的代謝途徑主要為3種:氧化為甜菜堿、磷脂酰膽堿或乙酰膽堿的合成。在代謝過程中，通過關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，各途徑相互補(bǔ)償和制約，保證了膽堿的代謝平衡［27］。當(dāng)然，飼糧中膽堿的豐盈程度是動(dòng)物機(jī)體膽堿代謝的重要因素。楊永明等［19］用浸提去除膽堿的飼糧飼喂大鼠發(fā)現(xiàn)，肝臟膽堿水平降低的同時(shí)，細(xì)胞膜的磷脂含量也明顯下降。膽堿利用擴(kuò)散機(jī)制穿透質(zhì)膜，或借助其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在機(jī)體各組織器官中蓄積。膽堿的運(yùn)輸主要依靠3個(gè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn):低親和力的易化擴(kuò)散、高親和力的Na+依賴載體運(yùn)輸以及中等親和力的Na+獨(dú)立運(yùn)輸體系。以上3個(gè)系統(tǒng)分別由3種特異性蛋白完成:膽堿低親和力有機(jī)陽離子載體(OCTs)、膽堿高親和力載體(CHT1)和中等親和力膽堿載體樣蛋白(CTL1)。CHT1和CTL1對(duì)膽堿的轉(zhuǎn)運(yùn)有更高的針對(duì)性和特異性。CHT1在神經(jīng)系統(tǒng)聚集，幾乎提供所有用于乙酰膽堿合成的原料;而CTL1則是膽堿最豐富的產(chǎn)物——磷脂酰膽堿的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體［28］。乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的合成是膽堿運(yùn)輸?shù)南匏俨襟E。因此，膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)載體直接決定著機(jī)體膽堿的利用及分布情況，也是維持機(jī)體膽堿平衡的重要保證。有研究發(fā)現(xiàn)，腎小管中的膽堿載體在維持機(jī)體分泌與重吸收血漿膽堿濃度的恒定方面扮演著重要作用［29］。在本試驗(yàn)條件下，2個(gè)劑量組的Tmax相同，說明膽堿在機(jī)體的吸收速度與其攝入的濃度無關(guān)，也進(jìn)一步佐證了膽堿運(yùn)轉(zhuǎn)載體對(duì)膽堿吸收速率的關(guān)鍵作用。在本研究中，200 mg劑量組的 Vz/F和CL/F均顯著高于400 mg劑量組，證明膽堿由血液進(jìn)入組織的過程并非是單純的依靠濃度梯度擴(kuò)散，而需要運(yùn)輸?shù)鞍讈硗瓿?，并且擴(kuò)散速率受運(yùn)輸?shù)鞍椎闹萍s。然而血液中高濃度的膽堿反而降低了膽堿進(jìn)入組織中的量。有研究顯示，膽堿過量會(huì)導(dǎo)致雞生長受阻，引起豬巨細(xì)胞性貧血。從生理方面來講，膽堿過量會(huì)引起類似副交感神經(jīng)過度興奮，血管擴(kuò)張、血壓下降、心跳變慢、胃腸蠕動(dòng)增強(qiáng)等現(xiàn)象，妨礙畜禽正常生長［30］。前人研究中不乏有關(guān)過量膽堿對(duì)動(dòng)物機(jī)體不良影響的報(bào)道，在畜禽飼糧中添加添加適量的膽堿可提高動(dòng)物的生長性能，但過高劑量會(huì)使生長性能下降［31－33］，研究者大多認(rèn)為是過量的膽堿阻礙了機(jī)體對(duì)鈣、磷等其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收所致［5］。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，過量添加氯化膽堿降低動(dòng)物生長性能的原因可能與膽堿的運(yùn)輸速率受抑制有關(guān)，但高濃度氯化膽堿如何抑制膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)尚未見報(bào)道。

氯化膽堿作為目前最常用最經(jīng)濟(jì)的甲基供體，經(jīng)常在畜禽飼糧中超量添加以期更高的生產(chǎn)性能，但忽略了動(dòng)物機(jī)體對(duì)膽堿的利用率以及由此造成的浪費(fèi)。本次試驗(yàn)提示，盡管無外源補(bǔ)充，肉雞體內(nèi)仍可穩(wěn)定持續(xù)地合成膽堿，但量非常有限，通過飼料額外添加時(shí)必要的。但并非越多越好。本試驗(yàn)中，雖然400 mg/kg劑量組進(jìn)入血液的有效成分較多，但200 mg/kg劑量組膽堿在體內(nèi)的分布較廣，血液中的膽堿容易進(jìn)入細(xì)胞或脂肪組織中，參試物在體內(nèi)存留時(shí)間較長，消除緩慢，更利于肉雞體內(nèi)物質(zhì)的生物合成。由此可見，雖然口服400 mg/kg氯化膽堿可增加進(jìn)入機(jī)體循環(huán)膽堿的相對(duì)數(shù)量，但無法提高機(jī)體對(duì)膽堿的利用效率?？梢姡?周齡肉雞飼糧中添加750 mg/kg膽堿時(shí)利用率較高，但添加1 500 mg/kg時(shí)對(duì)其發(fā)揮正常作用有負(fù)面影響。因此，盲目地增加氯化膽堿的添加量并非明智之舉。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)提示，單靠增加劑量來提高膽堿生物利用度，不僅不能達(dá)到預(yù)期目的，反而會(huì)增加機(jī)體的負(fù)擔(dān)，造成資源的浪費(fèi)。

［1］ MICHAEL D V.Choline’s key role in poultry diet revisited:choline plays many important metabolic roles in poultry，and to maximize the bird’s growth or performance，the diet must contain choline［J］.Feedstuffs，2010，82(5):1－3.

［2］ BAKER D H，CZARNECKI G L.Transmethylation of homocysteine to methionine:efficiency in the rat and chick［J］.Journal of Nutrition，1985，115(10):1291－1299.

［3］ 李建亞.膽堿的生理功能和飼料添加［J］.中國飼料，1990(2):28－30.

［4］ FEEDAP.Scientific Opinion on safety and efficacy of choline chloride as a feed additive for all animal species［J］.EFSA Journal，2011，9(9):2353－2367.

［5］ 蔡輝益，文杰，齊廣海，等.雞的營養(yǎng)［M］.4版.中國北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007:205－211.

［6］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5413.20—1997嬰幼兒配方食品和乳粉膽堿的測(cè)定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1997.

［7］ 薛靜.離子色譜法和高效液相色譜法測(cè)定奶粉中膽堿含量的研究［D］.碩士學(xué)位論文.長春:東北師范大學(xué)，2008:18－26.

［8］ 李媛媛，薛靜，李瑩倩，等.離子色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉中的膽堿含量［J］.食品科技，2008，33(12):267－270.

［9］ 丁永勝，牟世芬.離子色譜法測(cè)定飼料中氯化膽堿和三甲胺的含量［J］.色譜，2004，22(2):174－176.

［10］ 鄭洪國，寧張磊，梁立娜.離子色譜法檢測(cè)氯化膽堿及雜質(zhì)胺/銨的含量［J］.飼料工業(yè)，2009，30(5):26－28.

［11］ 黃麗，劉京平，容曉文.在線滲析—離子色譜法直接測(cè)定奶粉中膽堿［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(3):444－445，457.

［12］ LAIKHTMAN M，ROHRER J S.Determination of choline in infant formula by ion chromatography［J］.Journal of AOAC International，1999，82(5):1156 －1162.

［13］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T17481—2008預(yù)混料中氯化膽堿的測(cè)定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［14］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.HG/T 2941—2004飼料級(jí)氯化膽堿的測(cè)定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

［15］ BREMER J，GREENBERG D M.Biosynthesis of choline in vitro［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1960，37(1):173－175.

［16］ CREWS F T，HIRATA F，AXELROD J.Identification and properties of methyltransferases that synthesize phosphatidylcholine in rat brain synaptosomes［J］.Journal of Neurochemistry，1980，34(6):1491－1498.

［17］ BLUSZTAJN J K，ZEISEL S H，WURTMAN R J.Synthesis of lecithin (phosphatidylcholine)from phosphatidylethanolamine in bovine brain［J］.Brain Research，1979，179(2):319－327.

［18］ WURTMAN R J，CANSEV M，ULUS I H.Choline and its products acetylcholine and phosphatidylcholine［M］//LAJTHA A，TETTAMANTI G，GORACCI G.Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology:Neural Lipids.Berlin Heidelberg:Springer－Verlag，2010:443－501.

［19］ 楊永明，盧德勛，甄玉國.膽堿及其應(yīng)用［J］.飼料博覽，2001(3):38－41.

［20］ SAVENDAHL L，MAR M H，UNDERWOOD L E，et al.Prolonged fasting in humans results in diminished plasma choline concentrations but does not cause liver dysfunction［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1997，66(3):622－625.

［21］ HIRSCH M J，GROWDON J H，WURTMAN R J.Relations between dietary choline or lecithin intake，serum choline levels，and various metabolic indices［J］.Metabolism，1978，27(8):953－960.

［22］ ZEISEL S H，DA COSTA K-A，F(xiàn)RANKLIN P D，et al.Choline，an essential nutrient for humans［J］.The FASEB Journal，1991，5(7):2093－2098.

［23］ KLEIN J，K?PPEN A，L?FFELHOLZ K.Regulation of free choline in rat brain:dietary and pharmacological manipulations［J］.Neurochemistry International，1998，32(5/6):479－485.

［24］ DEGANI H，ELIYAHU G，MARIL N.Choline metabolism:meaning and significance［C］//Syllabus educational course international society for magnetic resonance in medicine，［S.l.］:［s.n.］，2006.

［25］ DE LA HUERGA J，POPPER H.Urinary excretion of choline metabolites following choline administration in normals and patients with hepatobiliary diseases［J］.The Journal of Clinical Investigation，1951，30(5):463－470.

［26］ NEILL A R，GRIME D W，DAWSON R M.Conversion of choline methyl groups through trimethylamine into methane in the rumen［J］.Biochemical Journal，1978，170(3):529－535.

［27］ JACOBSR L，STEAD L M，DEVLIN C，et al.Physiological regulation of phospholipid methylation alters plasma homocysteine in mice［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280(31):28299－28305.

［28］ MICHEL V，YUAN Z，RAMSUBIR S，et al.Choline transport for phospholipid synthesis［J］.Experimental Biology and Medicine，2006，231(5):490－504.

［29］ DANTZLER W H，EVANS K K，WRIGHT S H.Basolateral choline transport in isolated rabbit renal proximal tubules［J］.Pflügers Archiv，1998，436(6):899－905.

［30］ 倪玉姣.低能量水平下商品蛋雞膽堿適宜需要量的研究［D］.碩士學(xué)位論文.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012:9.

［31］ SOUTHERN L L，BROWN D R，WERNER D D，et al.Excess supplemental choline for swine［J］.Journal of Animal Science，1986，62(4):992－996.

［32］ VACHHRAJANI K D，SAHU A P，DUTTA K K.Excess choline availability:a transient effect on spermatogenesis in the rat［J］.Reproductive Toxicology，1993，7(5):477－481.

［33］ 周源，馮國強(qiáng)，李丹丹，等.黃羽肉雞對(duì)膽堿的需要量研究［J］.中國家禽，2011，33(3):14－17.