蔣國禮 范覺鑫， 張 彬 李麗立* 印遇龍*

(1.中國科學(xué)院大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物生態(tài)營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實驗室，長沙 410125;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

過去幾十年里，肥胖及其相關(guān)疾病(如2型糖尿病、血脂異常及高血壓)在全世界范圍內(nèi)流行［1］。而且絕經(jīng)期婦女容易肥胖的問題也受到廣泛關(guān)注。肥胖主要是由能量代謝紊亂引起，而且還與高胰島素血癥、胰島素抗性及脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)。動物機體脂肪代謝要受到多種激素調(diào)節(jié)，如雌激素、生長激素、甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素、胰島素及胰島素樣生長因子都是些常見的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的激素［2］。近年來的一些研究表明，雌激素對于動物脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)起到了不可忽視的作用［3］。雌激素可以抑制脂肪細(xì)胞中脂肪合成相關(guān)基因的表達，促進脂肪細(xì)胞的脂肪分解，并且還可以激活肌肉內(nèi)脂質(zhì)氧化［4］。雌激素還被證明與成熟動物采食量降低、脂肪沉積及體重有關(guān)［5］。絕經(jīng)期婦女由于雌激素分泌的銳減，導(dǎo)致機體代謝紊亂，進而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、糖尿病、冠心病和老年癡呆等一系列疾病的發(fā)病率提高。由此可見，雌激素的劇降是絕經(jīng)動物容易肥胖的一個關(guān)鍵因素。為了控制肥胖，研究者們正在努力尋找新的方法。為此，具有雌激素特性的藥物(如大豆異黃酮等植物性激素)及外源性雌激素(如戊酸雌二醇)替代療法進入了研究者們的視野。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，外源性雌激素替代療法對于控制肥胖(尤其是絕經(jīng)期婦女肥胖)具有一定效果。但是目前關(guān)于外源性雌激素對動物機體脂質(zhì)代謝影響的研究，絕大多數(shù)以更年期動物模型為研究對象，而以非更年期動物模型為研究對象的卻少見報道。外源性雌激素是否會影響雌激素分泌正常動物的脂質(zhì)代謝有待進一步研究。

人和動物的脂肪組織(尤其是白色脂肪組織)在能量平衡的維持及脂質(zhì)代謝方面起到了關(guān)鍵作用［6］。前人研究也表明，外源性雌激素對動物機體白色脂肪組織中的脂質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用，但是其作用機理仍然沒有完全被研究清楚。本研究以青年雌性香豬(雌激素分泌正常)為受試動物，旨在探討戊酸雌二醇對白色脂肪組織脂質(zhì)代謝的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

按單因子試驗設(shè)計，在廣西巴馬縣某香豬養(yǎng)殖場選擇20頭健康的35日齡雌性巴馬香豬，隨機分為2個組，即對照組與試驗組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.66 mg/kg戊酸雌二醇［相當(dāng)于0.5 mg/kg雌二醇(E2)］(Delpharm Lille S.A.S，法國)的試驗飼糧。本試驗外源性雌激素的添加水平是根據(jù)本課題組前期研究報道［7］確定，前期研究表明飼糧中添加0.5 mg/kg的雌激素對小型香豬具有一定的生理效用。試驗周期為120 d。根據(jù)巴馬香豬的營養(yǎng)需要和生理特點，配制第1階段(1～60 d)和第2階段(61～120 d)基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.2 飼養(yǎng)管理

飼喂前清洗食槽，每天08:00、16:00分2次喂料。各組均采取限飼，每天飼喂量為體重的3%(飼喂過程中，每隔2周稱重1次，飼喂量即為每次稱重后體重的3%)。豬只單欄飼養(yǎng)，試驗全期豬只自由飲水。

1.3 取樣方法及胴體分割

飼養(yǎng)結(jié)束后，每組隨機抽取5頭豬進行屠宰試驗。屠宰前1天對各組香豬稱重并記錄其末體重。禁食12 h后屠宰，宰前進行前腔靜脈采血，離心分離血清后于-20℃保存，用于后續(xù)檢測。采血后屠宰，去頭、蹄、尾及內(nèi)臟，保留腎臟及板油，得到胴體。將胴體分為左右兩半，左半胴體用于取脂肪樣品，右半胴體用于胴體分割。于左半胴體取背部皮下脂肪、腹部皮下脂肪及腎周脂肪樣各4份，每份約1 g，用錫箔紙包好，液氮速凍后保存于-80℃，備用。右半胴體分割前稱重并記錄，仔細(xì)分離出皮下脂肪及板油，合并所分離脂肪稱重并記錄。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能指標(biāo)測定

體脂肪率=右半胴體脂肪重/右半胴體重。

1.4.2 血液生化指標(biāo)測定

血液中葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白(LDL)含量采用全自動生化分析儀測定，試劑盒購自北京利得曼生化股份有限公司。

1.4.3 血液E2水平測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法進行血液E2水平測定。將血清于室溫解凍后，1 000×g離心20 min后根據(jù)試劑盒的說明書進行測定，試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.4.4 白色脂肪組織中脂肪代謝相關(guān)基因及雌激素受體基因相對表達水平的測定

1.4.4.1 引物合成

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體引物序列見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for fluorescence-based quantitative real-time PCR

1.4.4.2 實時熒光定量 PCR

用Trizol試劑(Invitrogen)提取各脂肪組織樣品中總RNA。對所提總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA質(zhì)量后用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)實時熒光定量PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△Ct相對定量計算公式，分析各脂肪組織中目的基因mRNA相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)先用 Excel進行預(yù)處理，再用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬生長性能及體脂肪率的影響

戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬生長性能及體脂肪率的影響見表3。與對照組相比，試驗組雌性香豬的末體重、體增重及脂肪率均顯著降低(P＜0.05)，表明戊酸雌二醇抑制了雌性香豬的體增重及脂肪的沉積。

表3 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬生長性能及體脂肪率的影響Table 3 Effects of estradiol valerate on growth performance and body fat percentage of female Bama Xiang-pigs

2.2 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬血液生化指標(biāo)及E2水平的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗組雌性香豬血液GLU、TG 及LDL含量均顯著降低(P＜0.05)，表明戊酸雌二醇可以改善雌性香豬血糖及血脂水平。戊酸雌二醇對雌性香豬血液E2水平的影響不顯著(P＞0.05)，但相比于對照組，試驗組雌性香豬血液E2水平有升高的趨勢。

表4 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬血液生化指標(biāo)及雌二醇水平的影響Table 4 Effects of estradiol valerate on blood biochemical indices and E2 level of female Bama Xiang-pigs

2.3 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬白色脂肪組織中脂肪代謝相關(guān)基因及雌激素受體基因表達的影響

戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬白色脂肪組織中脂肪代謝相關(guān)基因及雌激素受體基因表達的影響見表5。

與對照組相比，試驗組雌性巴馬香豬背部皮下脂肪中脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶-A羧化酶(ACC)及脂蛋白脂肪酶(LPL)的mRNA的相對表達水平顯著降低(P＜0.05)，激素敏感脂肪酶(HSL)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)及雌激素受體-β(ER-β)的mRNA相對表達水平顯著升高(P＜0.05)，過氧化物酶體增殖因子受體-γ(PPAR-γ)、過氧化物酶體增殖因子受體-α(PPAR-α)及雌激素受體-α(ER-α)的mRNA相對表達水平無顯著變化(P＞0.05)。

與對照組相比，試驗組雌性巴馬香豬腹部皮下脂肪中的FAS、ACC及LPL的mRNA相對表達水平顯著降低(P＜0.05)，PPAR-α、HSL、ATGL、ER-α及ER-β的mRNA相對表達水平顯著升高(P＜0.05)，PPAR-γ的mRNA相對表達水平無顯著變化(P＞0.05)。

與對照組相比，試驗組雌性巴馬香豬腎周脂肪中的 PPAR-γ、FAS、ER-α 及 ER-β 的 mRNA 相對表達水平顯著降低(P＜0.05)，HSL、ATGL 及 LPL的mRNA相對表達水平顯著升高(P＜0.05)，ACC及PPAR-α的mRNA相對表達水平無顯著差異(P＞0.05)。

表5 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬白色脂肪組織中脂肪代謝相關(guān)基因及雌激素受體基因表達的影響Table 5 Effects of estradiol valerate on the expression of lipid metabolism related genes and ERs genes in white adipose tissues of female Bama Xiang-pigs

3 討論

3.1 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬生長性能及體脂肪率的影響

體增重及體脂肪率是衡量動物機體是否肥胖的2個重要表觀指標(biāo)。為了了解戊酸雌二醇是否能夠控制雌性巴馬香豬肥胖，本試驗測定了雌性香豬體增重及體脂肪率這2個指標(biāo)。Chmouliovsky等［10］研究表明，雌激素替代療法有利于胰島素反應(yīng)，促進血脂和能量消耗，并有利于提高脂質(zhì)氧化作用而使體重減輕。Hao等［11］研究表明，去卵巢大鼠飼喂雌激素后，體重及體脂肪重顯著下降。王瑞云等［12］報道，絕經(jīng)后婦女服用雌激素后，體重也有一定程度降低。這些報道的研究結(jié)果基本與本試驗結(jié)果一致。本試驗在非絕經(jīng)雌性香豬飼糧中添加戊酸雌二醇顯著降低了體增重及體脂肪率。

3.2 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬血清生化指標(biāo)的影響

糖脂代謝紊亂是心血管疾病的危險因素已被人們廣泛認(rèn)同，胰島素抵抗是絕經(jīng)婦女心血管疾病等慢性病發(fā)生的病理基礎(chǔ)。雌激素補充治療對絕經(jīng)婦女糖脂代謝及胰島素的影響也越來越受到公眾關(guān)注。血液中GLU、TG及LDL含量等生化指標(biāo)是動物機體糖脂代謝的間接反映指標(biāo)。近些年也有大量有關(guān)外源性雌激素對動物血糖、血脂影響的研究。楊樹琳等［13］研究表明，口服戊酸雌二醇可顯著降低自然更年期大鼠血液GLU、TG及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。楊樹琳等［14］還報道，戊酸雌二醇可以升高去勢大鼠血液高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，降低LDL-C含量，而對血液GLU及TG含量沒有顯著影響。本實驗結(jié)果證實:飼糧中添加戊酸雌二醇可以顯著降低雌性香豬血液GLU、TG及LDL含量，這與上述前人的研究結(jié)果基本保持一致。然而，也有些研究表明，飼糧添加雌激素對試驗動物血糖、血脂水平無顯著影響，甚至有升高血糖、血脂作用，這些研究結(jié)果的差異可能與給藥方式、給藥劑量、試驗動物性別有關(guān)。

雌激素已經(jīng)被證明與人或動物機體脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，并且絕經(jīng)婦女或動物容易肥胖的一個決定性因素就是體內(nèi)雌激素水平急劇下降。外源性雌激素替代治療之所以能夠改善脂質(zhì)代謝，其中的一個原因就是外源雌激素可以補給體內(nèi)雌激素，從而使動物機體雌激素水平上升達到正常水平。楊樹琳等［14］報道，戊酸雌二醇可以顯著升高去勢大鼠血液E2水平。王瑞云等［12］報道稱，絕經(jīng)婦女在接受戊酸雌二醇治療后，血液E2水平顯著升高。本試驗結(jié)果表明，戊酸雌二醇對雌性香豬血液E2水平無顯著影響，但有提高血液E2水平的趨勢。前人研究表明，外源性雌激素可以補給絕經(jīng)或更年期動物雌激素，從而使血液雌激素水平升高。但本試驗中，外源性雌激素對雌激素分泌正常的雌性香豬的血液雌激素水平的提高沒有像絕經(jīng)或更年期動物那么明顯，其中原因可能是因為雌激素分泌正常的雌性香豬的雌激素分泌具有反饋調(diào)節(jié)作用。雖然戊酸雌二醇對雌性香豬血液雌激素水平無顯著影響，但還是有一定的升高趨勢，可能少量的雌激素水平升高，也能夠發(fā)揮雌激素對香豬脂質(zhì)代謝調(diào)控的效應(yīng)。

3.3 戊酸雌二醇對雌性巴馬香豬白色脂肪組織中脂肪代謝相關(guān)基因及雌激素受體基因表達的影響

眾所周知，脂肪組織中脂質(zhì)代謝包括脂肪合成與脂肪分解代謝，脂肪組織質(zhì)量受脂肪合成與脂肪分解代謝平衡的調(diào)節(jié)。脂肪細(xì)胞的生長分化由激素引發(fā)的CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)與過氧化物酶體增殖因子受體(PPARs)協(xié)同作用調(diào)節(jié)，并且PPARs是最主要的脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子［15］。PPAR-α及PPAR-γ是PPARs蛋白家族的2個重要成員，PPAR-α主要調(diào)控脂肪分解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而PPAR-γ主要調(diào)控脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達及胰島素感應(yīng)［15］。FAS及 ACC是 PPAR-γ的2個重要的下游基因，在脂肪合成代謝中起到關(guān)鍵作用［6，16］。HSL 及 ATGL 是 PPAR-α 的 2 個重要的下游基因，ATGL是脂肪分解過程中的關(guān)鍵酶，主要負(fù)責(zé)TG分解代謝的第1步，HSL是脂肪組織中TG分解代謝過程中另一個關(guān)鍵酶，主要負(fù)責(zé)TG分解代謝的第2步(即將二酰甘油分解為單酰甘油)［17］。因此，可以將PPAR-γ、FAS及ACC稱為脂肪合成基因，而將PPAR-α、HSL及ATGL稱為脂肪分解基因。本試驗結(jié)果表明，飼糧添加戊酸雌二醇抑制了雌性巴馬香豬白色脂肪組織中脂肪合成基因的表達，而促進了脂肪分解基因的表達，由此可見，戊酸雌二醇可能通過抑制脂肪合成途徑及促進脂肪分解途徑來調(diào)控白色脂肪組織脂質(zhì)代謝。

雌激素是雄性及雌性動物脂肪組織中調(diào)控脂肪細(xì)胞生長和數(shù)量的關(guān)鍵激素［18］。Misso等［19］研究表明，雌激素與雌激素受體結(jié)合可以降低LPL(一種調(diào)控脂肪細(xì)胞攝取脂質(zhì)的關(guān)鍵酶)的活性來抑制脂肪合成。雌激素受體廣泛分布于各脂肪組織中，ER-α及ER-β是動物組織中表達的2種主要的雌激素受體，且均與雌激素有良好的親和能力。既然雌激素可以通過與雌激素受體的結(jié)合來抑制脂肪的合成，那么我們可以認(rèn)為，除了對脂肪合成與脂肪分解基因表達的調(diào)節(jié)，戊酸雌二醇還有可能通過對雌激素受體基因表達的調(diào)控來調(diào)節(jié)脂肪的合成。本試驗結(jié)果表明:戊酸雌二醇上調(diào)了背部及腹部皮下脂肪中ER-α及ER-β的表達，且下調(diào)了背部及腹部皮下脂肪中LPL的表達;但卻下調(diào)了腎周脂肪中ER-α及ER-β的表達，上調(diào)了腎周脂肪中LPL的表達。由此可見，飼糧中添加戊酸雌二醇的確可以通過調(diào)節(jié)脂肪組織中雌激素受體基因的表達來調(diào)節(jié)LPL的表達，進而影響脂肪組織中脂質(zhì)的合成。由這些結(jié)果還可以看出，戊酸雌二醇對雌激素受體基因表達的調(diào)節(jié)具有部位特異性，這與Dieudonné等［20］的研究結(jié)果一致，Dieudonné等［20］發(fā)現(xiàn)，對來自不同脂肪組織的脂肪細(xì)胞進行雌激素處理，不同脂肪組織的脂肪細(xì)胞中雌激素受體基因的表達不一致。

4 結(jié)論

①戊酸雌二醇可以有效地控制雌性巴馬香豬的體增重及脂肪的沉積，并且能有效地改善血糖及血脂水平。

②戊酸雌二醇可能通過2個途徑來調(diào)節(jié)非絕經(jīng)雌性香豬白色脂肪組織中的脂質(zhì)代謝:其一，通過對脂肪合成及脂肪分解相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)來影響脂質(zhì)代謝;其二，通過對雌激素受體基因表達的調(diào)節(jié)來調(diào)控LPL的表達，進而影響脂肪的合成代謝。

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