湯 俊 王愛(ài)娜 陳代文 毛湘冰* 陳 浩 劉明輝余 冰 何 軍 鄭 萍 虞 潔 王曲圓

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014;2.濰坊工商職業(yè)學(xué)院，諸城 262234)

輪狀病毒(rotavirus，RV)是仔豬病原性腹瀉的主要致病因子之一。流行病學(xué)上的研究發(fā)現(xiàn)，仔豬對(duì)RV極為易感，RV感染初生仔豬死亡率可達(dá)100%。已有的研究表明，RV感染可引起幼齡動(dòng)物抗氧化能力降低，尤其可引起腸道細(xì)胞抗氧化物質(zhì)的活性降低，促進(jìn)了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，繼而產(chǎn)生損傷，而這一過(guò)程可能是RV導(dǎo)致仔豬腹瀉的發(fā)病機(jī)制之一［1－3］。

而近年的研究也發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳酸桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)具有較強(qiáng)的抗氧化能力［4－6］，并對(duì)多種應(yīng)激源誘導(dǎo)的氧化損傷有顯著緩解作用［7］。Sun 等［8］研究也發(fā)現(xiàn)飼喂 LGG可以清除小鼠應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧(ROS)，抑制產(chǎn)生ROS的微生物，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。崔志文等［9］報(bào)道，鼠李糖乳酸桿菌可以提高Caco-2細(xì)胞的抗氧化能力。結(jié)合前人研究結(jié)果推測(cè)，飼糧中LGG補(bǔ)充可能會(huì)在一定程度上緩解RV誘導(dǎo)的仔豬抗氧化能力降低，但相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)的目的在于考察飼糧中添加LGG對(duì)RV感染仔豬生產(chǎn)性能和抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LGG菌粉:1010CFU/g，脫脂乳包被(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心提供)。

RV:OSU毒株(G5P9)株(ATCC#VR-893)，購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選取24頭健康的21日齡的“杜×長(zhǎng)×大”去勢(shì)公豬，平均體重為(6.69±0.32)kg。試驗(yàn)采用2×2兩因素設(shè)計(jì)，飼糧中分別添加 0和109CFU/kg的LGG，用RV進(jìn)行感染處理。試驗(yàn)第1天空腹稱重，根據(jù)體重相近原則隨機(jī)分為2個(gè)處理，每個(gè)處理12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，全部豬只單籠飼養(yǎng)，2個(gè)處理分別飼喂添加或未添加LGG的飼糧。試驗(yàn)第15天，空腹稱重，根據(jù)體重相近、健康狀況相當(dāng)?shù)脑瓌t，每個(gè)處理隨機(jī)選取6頭仔豬口服RV 3 mL，剩余仔豬口服無(wú)菌MEM培養(yǎng)基3 mL。感染后，試驗(yàn)為4個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)期為19 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧及營(yíng)養(yǎng)水平

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧為玉米－豆粕型，參照NRC(2012)7～11 kg階段豬營(yíng)養(yǎng)需要配制。試驗(yàn)飼糧分別于基礎(chǔ)飼糧中添加0和109CFU/kg的鼠李糖乳酸桿菌構(gòu)成，添加的鼠李糖乳酸桿菌等量替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行。豬的飼養(yǎng)采用分4個(gè)時(shí)間點(diǎn)定時(shí)飼喂(分別是 08:00、12:00、16:00、20:00)，飼喂量確保料槽內(nèi)略有剩余，自由飲水，圈舍溫度控制在27～30℃，濕度不高于80%，各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。

1.5 RV 培養(yǎng)

研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴腎細(xì)胞(MA104)對(duì)RV高度易感，最適宜用于其體外培養(yǎng)［10－12］。因而，本試驗(yàn)選用MA104細(xì)胞進(jìn)行RV的培養(yǎng)和強(qiáng)化，使用病毒為RV OSU毒株。MA104細(xì)胞使用MEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到70% ～80%時(shí)接種病毒，37℃感染2 h，隨后補(bǔ)足MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，收毒。RV在細(xì)胞上多次傳代可以提高病毒毒力，收集的病毒重復(fù)上述步驟數(shù)次，當(dāng)接種病毒后72 h，70%以上細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，收集病毒，測(cè)定毒力，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrition levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.6 RV 接種

試驗(yàn)第15天稱重，按體重相近及豬只健康狀況為原則進(jìn)行組內(nèi)分組，分別對(duì)2個(gè)感染處理口服感染1.4×107TCID50/mL RV 3 mL，2 個(gè)未感染處理灌服3 mL無(wú)菌MEM培養(yǎng)基。

1.7 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.7.1 生產(chǎn)性能

以重復(fù)為單位，于試驗(yàn)第1、15和20天對(duì)豬進(jìn)行空腹稱重，記錄每日的采食量，計(jì)算各階段及全期平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.7.2 腹瀉指標(biāo)

每日記錄感染后仔豬腹瀉程度和頭數(shù)，統(tǒng)計(jì)腹瀉情況并計(jì)算腹瀉指數(shù)。糞便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。參照Yuan等［13］，腹瀉指數(shù)的計(jì)算公式如下:

腹瀉指數(shù)=SUM腹瀉評(píng)分/總頭數(shù)。

表2 腹瀉情況發(fā)生評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The standard that fecal consistency was scored

1.7.3 抗氧化能力

1.7.3.1 血清抗氧化能力

于試驗(yàn)第20天對(duì)豬空腹進(jìn)行前腔靜脈采血置于普通離心管，室溫下靜置30 min，3 000 r/min離心15 min制備血清，－20℃保存，用于測(cè)定血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAOC)。所有試劑均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所，操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7.3.2 腸道抗氧化能力

試驗(yàn)第20天采血后重新飼喂仔豬，并于2 h后，屠宰全部試驗(yàn)豬，各稱取約1 g十二指腸、空腸、回腸腸道組織，按重量體積比1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，置冰上勻漿后，勻漿液于冷凍離心機(jī)中按不同指標(biāo)要求轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，保存于－80℃，用于測(cè)定十二指腸、空腸、回腸組織中MDA水平，T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC。所有試劑均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所，操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行初步整理，采用SAS 8.0軟件中兩因子方差分析，模型主效應(yīng)包括RV感染和鼠李糖乳酸桿菌以及二者之間的互作，差異顯著后進(jìn)行Duncan氏多重比較，各指標(biāo)以每個(gè)重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)。以P＜0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 飼糧中添加LGG對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

飼糧中添加LGG對(duì)RV感染及未感染仔豬生產(chǎn)性能的影響如表3所示。從表中可以看出，試驗(yàn)第1～14天，添加LGG可顯著降低F/G(P＜0.05)，對(duì)ADFI和ADG無(wú)顯著影響(P＞0.05)。感染后(第15～19天)，添加LGG可顯著降低F/G(P＜0.05)，對(duì)ADFI和ADG 無(wú)顯著影響(P＞0.05);但RV感染顯著提高了 F/G(P＜0.05)，對(duì) ADFI和 ADG無(wú)顯著影響(P＞0.05)。LGG的添加和RV感染對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能無(wú)顯著交互作用(P＞0.05)。

2.2 飼糧中添加LGG對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影響

飼糧中添加LGG對(duì)RV感染及未感染仔豬腹瀉的影響如表4所示。從表中可以看出，RV感染顯著提高了仔豬的腹瀉指數(shù)(P＜0.05)。添加LGG顯著降低了仔豬的腹瀉指數(shù)(P＜0.05);且LGG的添加可以顯著降低RV感染引起的腹瀉指數(shù)增加(P＜0.05)，二者存在顯著的交互作用(P＜0.05)。

表3 飼糧中添加LGG和/或RV感染對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響Table 3 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the performance in weaned piglets

表4 飼糧中添加LGG和/或RV感染對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影響Table 4 Effect of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the diarrhea in weaned piglets

2.3 飼糧中添加LGG對(duì)斷奶仔豬抗氧化能力的影響

飼糧中添加LGG對(duì)RV感染及未感染仔豬抗氧化能力的影響如表5所示。從表中我們可以看出，RV感染顯著提高了十二指腸、空腸、回腸和血清中MDA水平(P＜0.05)，顯著影響了十二指腸、空腸、回腸和血清中GSH-Px的活性以及空腸中TSOD活性(P＜0.05)，以及空腸和血清中T-AOC(P＜0.05)，十二指腸 T-AOC 有降低趨勢(shì)(P＜0.10)。添加LGG顯著降低了空腸中 MDA水平(P＜0.05)，顯著提高了空腸中T-SOD和血清中GSH-Px活性(P＜0.05)，顯著提高了空腸和血清中T-AOC(P＜0.05)。LGG的添加顯著降低了RV感染引起的仔豬空腸中MDA水平的升高(P＜0.05)，顯著提高了RV感染引起的仔豬空腸和血清中T-AOC的下降(P＜0.05)，添加LGG與RV感染，二者表現(xiàn)出顯著的交互作用(P＜0.05)。

3 討論

腹瀉對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)危害極大，其發(fā)生不僅影響仔豬生產(chǎn)，甚至?xí)?dǎo)致仔豬死亡，嚴(yán)重影響仔豬的生產(chǎn)效益。RV對(duì)仔豬極為易感，是造成仔豬病毒性腹瀉的主要因素之一，而RV誘導(dǎo)的腸道抗氧化能力降低可能是其導(dǎo)致腹瀉的重要機(jī)制。本研究采用對(duì)仔豬口服灌注RV，構(gòu)建RV感染模型，模擬生產(chǎn)實(shí)際中RV感染誘導(dǎo)仔豬腹瀉的發(fā)生。結(jié)果表明，RV感染仔豬腹瀉指數(shù)顯著高于對(duì)照組，且顯著提高了仔豬的F/G，但未顯著影響ADFI和ADG，即RV感染降低了仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率;RV感染也降低了仔豬腸道和血清的抗氧化能力，誘導(dǎo)了機(jī)體和腸道的氧化應(yīng)激，這與前人的研究結(jié)果一致［3，14］。綜上結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了 RV 感染模型。

近年相關(guān)的研究表明，飼糧補(bǔ)充LGG可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，減少腹瀉的發(fā)生。王海東等［15］在斷奶仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.2%鼠李糖乳酸桿菌菌粉極顯著提高了仔豬日增重，顯著改善了飼料轉(zhuǎn)化率，同時(shí)降低了斷奶期仔豬腹瀉率。在斷乳小鼠飼糧中分別添加102、104、106、108CFU/(只·d)鼠李糖乳酸桿菌MA27/B，與對(duì)照組相比，各添加組采食量、飲水量及日增重都顯著提高，且作用效果具有劑量依賴效應(yīng)［16］。Suraw-icz［17］研究發(fā)現(xiàn)，LGG可以顯著降低抗生素相關(guān)性腹瀉的發(fā)生。Basu等［18］在患急性水樣腹瀉兒童上的研究發(fā)現(xiàn)，使用高劑量LGG可以顯著降低患病兒腹瀉持續(xù)的時(shí)間及頻率。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)基本一致。另外，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，飼糧中LGG補(bǔ)充可在一定程度上緩解RV感染誘導(dǎo)的腹瀉產(chǎn)生，這可能與LGG可提高仔豬抗氧化能力有關(guān)。

表5 飼糧中添加LGG和/或RV感染對(duì)斷奶仔豬十二指腸、空腸、回腸和血清抗氧化能力的影響Table 5 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the antioxidant capacity in the duodenum，jejunum，ileum and serum in weaned piglets

諸多研究報(bào)道，LGG有很強(qiáng)的抗氧化能力。胡曉麗［19］在DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的研究中發(fā)現(xiàn)，飼喂LGG可以顯著降低結(jié)腸髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性、ROS和MDA水平，提高結(jié)腸組織T-AOC和多種抗氧化酶活性。李垚清等［20］探討了多種乳酸菌對(duì)MDA的抑制作用，發(fā)現(xiàn)LGG可以明顯抑制MDA生成。王玉華等［21］在鼠李糖乳酸桿菌B10對(duì)酒精誘導(dǎo)肝氧化損傷的小鼠上的研究表明，鼠李糖乳酸桿菌B10顯著降低了小鼠肝臟脂肪變性和氧化損傷程度，緩解了小鼠酒精性肝損傷。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，飼糧添加LGG可以顯著提高仔豬血清和空腸的T-AOC。而本研究也表明飼糧LGG添加可在一定程度上緩解RV感染誘導(dǎo)的仔豬血液和腸道抗氧化能力下降，可以推測(cè)LGG緩解RV誘導(dǎo)的仔豬腹瀉與其緩解氧化應(yīng)激產(chǎn)生的腸道損傷有關(guān)。另外，本研究的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，雖然飼糧補(bǔ)充LGG緩解RV誘導(dǎo)的T-AOC降低和MDA水平升高，但未緩解RV對(duì)T-SOD和GSH-Px活性的影響，因此，可以進(jìn)一步推測(cè)LGG緩解RV誘導(dǎo)的仔豬腸道抗氧化能力下降可能主要是通過(guò)非酶抗氧化系統(tǒng)的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

飼糧LGG的添加可以顯著降低仔豬的料重比，并可緩解RV感染誘導(dǎo)的斷奶仔豬腹瀉，這可能源于飼糧LGG添加提高了仔豬機(jī)體(尤其是腸道)抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物，維持機(jī)體正常氧化還原平衡，繼而增強(qiáng)仔豬的抗病力。

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