湯 俊 王愛娜 陳代文 毛湘冰* 陳 浩 劉明輝余 冰 何 軍 鄭 萍 虞 潔 王曲圓

(1.四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，雅安 625014;2.濰坊工商職業(yè)學院，諸城 262234)

輪狀病毒(rotavirus，RV)是仔豬病原性腹瀉的主要致病因子之一。流行病學上的研究發(fā)現(xiàn)，仔豬對RV極為易感，RV感染初生仔豬死亡率可達100%。已有的研究表明，RV感染可引起幼齡動物抗氧化能力降低，尤其可引起腸道細胞抗氧化物質的活性降低，促進了脂質過氧化反應，繼而產生損傷，而這一過程可能是RV導致仔豬腹瀉的發(fā)病機制之一［1－3］。

而近年的研究也發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳酸桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)具有較強的抗氧化能力［4－6］，并對多種應激源誘導的氧化損傷有顯著緩解作用［7］。Sun 等［8］研究也發(fā)現(xiàn)飼喂 LGG可以清除小鼠應激產生的活性氧(ROS)，抑制產生ROS的微生物，增強機體抗氧化能力。崔志文等［9］報道，鼠李糖乳酸桿菌可以提高Caco-2細胞的抗氧化能力。結合前人研究結果推測，飼糧中LGG補充可能會在一定程度上緩解RV誘導的仔豬抗氧化能力降低，但相關研究尚未見報道。因此，本試驗的目的在于考察飼糧中添加LGG對RV感染仔豬生產性能和抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LGG菌粉:1010CFU/g，脫脂乳包被(中國農業(yè)大學農業(yè)部飼料工業(yè)中心提供)。

RV:OSU毒株(G5P9)株(ATCC#VR-893)，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗動物與設計

本試驗選取24頭健康的21日齡的“杜×長×大”去勢公豬，平均體重為(6.69±0.32)kg。試驗采用2×2兩因素設計，飼糧中分別添加 0和109CFU/kg的LGG，用RV進行感染處理。試驗第1天空腹稱重，根據體重相近原則隨機分為2個處理，每個處理12個重復，每個重復1頭豬，全部豬只單籠飼養(yǎng)，2個處理分別飼喂添加或未添加LGG的飼糧。試驗第15天，空腹稱重，根據體重相近、健康狀況相當的原則，每個處理隨機選取6頭仔豬口服RV 3 mL，剩余仔豬口服無菌MEM培養(yǎng)基3 mL。感染后，試驗為4個處理，每個處理6個重復，每個重復1頭豬。試驗期為19 d。

1.3 試驗飼糧及營養(yǎng)水平

試驗基礎飼糧為玉米－豆粕型，參照NRC(2012)7～11 kg階段豬營養(yǎng)需要配制。試驗飼糧分別于基礎飼糧中添加0和109CFU/kg的鼠李糖乳酸桿菌構成，添加的鼠李糖乳酸桿菌等量替代基礎飼糧中的玉米?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所教學試驗基地進行。豬的飼養(yǎng)采用分4個時間點定時飼喂(分別是 08:00、12:00、16:00、20:00)，飼喂量確保料槽內略有剩余，自由飲水，圈舍溫度控制在27～30℃，濕度不高于80%，各組飼養(yǎng)管理條件一致。

1.5 RV 培養(yǎng)

研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴腎細胞(MA104)對RV高度易感，最適宜用于其體外培養(yǎng)［10－12］。因而，本試驗選用MA104細胞進行RV的培養(yǎng)和強化，使用病毒為RV OSU毒株。MA104細胞使用MEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清進行培養(yǎng)，待細胞長到70% ～80%時接種病毒，37℃感染2 h，隨后補足MEM無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，收毒。RV在細胞上多次傳代可以提高病毒毒力，收集的病毒重復上述步驟數次，當接種病毒后72 h，70%以上細胞出現(xiàn)明顯細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，收集病毒，測定毒力，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrition levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.6 RV 接種

試驗第15天稱重，按體重相近及豬只健康狀況為原則進行組內分組，分別對2個感染處理口服感染1.4×107TCID50/mL RV 3 mL，2 個未感染處理灌服3 mL無菌MEM培養(yǎng)基。

1.7 測定指標及方法

1.7.1 生產性能

以重復為單位，于試驗第1、15和20天對豬進行空腹稱重，記錄每日的采食量，計算各階段及全期平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.7.2 腹瀉指標

每日記錄感染后仔豬腹瀉程度和頭數，統(tǒng)計腹瀉情況并計算腹瀉指數。糞便評分標準見表2。參照Yuan等［13］，腹瀉指數的計算公式如下:

腹瀉指數=SUM腹瀉評分/總頭數。

表2 腹瀉情況發(fā)生評判標準Table 2 The standard that fecal consistency was scored

1.7.3 抗氧化能力

1.7.3.1 血清抗氧化能力

于試驗第20天對豬空腹進行前腔靜脈采血置于普通離心管，室溫下靜置30 min，3 000 r/min離心15 min制備血清，－20℃保存，用于測定血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAOC)。所有試劑均購自于南京建成生物工程研究所，操作均按說明書進行。

1.7.3.2 腸道抗氧化能力

試驗第20天采血后重新飼喂仔豬，并于2 h后，屠宰全部試驗豬，各稱取約1 g十二指腸、空腸、回腸腸道組織，按重量體積比1∶9的比例加入預冷的生理鹽水，置冰上勻漿后，勻漿液于冷凍離心機中按不同指標要求轉速離心10 min，取上清液，保存于－80℃，用于測定十二指腸、空腸、回腸組織中MDA水平，T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC。所有試劑均購自于南京建成生物工程研究所，操作均按說明書進行。

1.8 數據處理與分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2007進行初步整理，采用SAS 8.0軟件中兩因子方差分析，模型主效應包括RV感染和鼠李糖乳酸桿菌以及二者之間的互作，差異顯著后進行Duncan氏多重比較，各指標以每個重復為單位統(tǒng)計。以P＜0.05為差異顯著判斷標準。所有數據均以“平均值±標準誤”表示。

2 結果

2.1 飼糧中添加LGG對斷奶仔豬生產性能的影響

飼糧中添加LGG對RV感染及未感染仔豬生產性能的影響如表3所示。從表中可以看出，試驗第1～14天，添加LGG可顯著降低F/G(P＜0.05)，對ADFI和ADG無顯著影響(P＞0.05)。感染后(第15～19天)，添加LGG可顯著降低F/G(P＜0.05)，對ADFI和ADG 無顯著影響(P＞0.05);但RV感染顯著提高了 F/G(P＜0.05)，對 ADFI和 ADG無顯著影響(P＞0.05)。LGG的添加和RV感染對斷奶仔豬生產性能無顯著交互作用(P＞0.05)。

2.2 飼糧中添加LGG對斷奶仔豬腹瀉的影響

飼糧中添加LGG對RV感染及未感染仔豬腹瀉的影響如表4所示。從表中可以看出，RV感染顯著提高了仔豬的腹瀉指數(P＜0.05)。添加LGG顯著降低了仔豬的腹瀉指數(P＜0.05);且LGG的添加可以顯著降低RV感染引起的腹瀉指數增加(P＜0.05)，二者存在顯著的交互作用(P＜0.05)。

表3 飼糧中添加LGG和/或RV感染對斷奶仔豬生產性能的影響Table 3 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the performance in weaned piglets

表4 飼糧中添加LGG和/或RV感染對斷奶仔豬腹瀉的影響Table 4 Effect of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the diarrhea in weaned piglets

2.3 飼糧中添加LGG對斷奶仔豬抗氧化能力的影響

飼糧中添加LGG對RV感染及未感染仔豬抗氧化能力的影響如表5所示。從表中我們可以看出，RV感染顯著提高了十二指腸、空腸、回腸和血清中MDA水平(P＜0.05)，顯著影響了十二指腸、空腸、回腸和血清中GSH-Px的活性以及空腸中TSOD活性(P＜0.05)，以及空腸和血清中T-AOC(P＜0.05)，十二指腸 T-AOC 有降低趨勢(P＜0.10)。添加LGG顯著降低了空腸中 MDA水平(P＜0.05)，顯著提高了空腸中T-SOD和血清中GSH-Px活性(P＜0.05)，顯著提高了空腸和血清中T-AOC(P＜0.05)。LGG的添加顯著降低了RV感染引起的仔豬空腸中MDA水平的升高(P＜0.05)，顯著提高了RV感染引起的仔豬空腸和血清中T-AOC的下降(P＜0.05)，添加LGG與RV感染，二者表現(xiàn)出顯著的交互作用(P＜0.05)。

3 討論

腹瀉對斷奶仔豬生產危害極大，其發(fā)生不僅影響仔豬生產，甚至會導致仔豬死亡，嚴重影響仔豬的生產效益。RV對仔豬極為易感，是造成仔豬病毒性腹瀉的主要因素之一，而RV誘導的腸道抗氧化能力降低可能是其導致腹瀉的重要機制。本研究采用對仔豬口服灌注RV，構建RV感染模型，模擬生產實際中RV感染誘導仔豬腹瀉的發(fā)生。結果表明，RV感染仔豬腹瀉指數顯著高于對照組，且顯著提高了仔豬的F/G，但未顯著影響ADFI和ADG，即RV感染降低了仔豬對營養(yǎng)物質的利用效率;RV感染也降低了仔豬腸道和血清的抗氧化能力，誘導了機體和腸道的氧化應激，這與前人的研究結果一致［3，14］。綜上結果表明，本試驗成功構建了 RV 感染模型。

近年相關的研究表明，飼糧補充LGG可提高動物的生產性能，減少腹瀉的發(fā)生。王海東等［15］在斷奶仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼糧中添加0.2%鼠李糖乳酸桿菌菌粉極顯著提高了仔豬日增重，顯著改善了飼料轉化率，同時降低了斷奶期仔豬腹瀉率。在斷乳小鼠飼糧中分別添加102、104、106、108CFU/(只·d)鼠李糖乳酸桿菌MA27/B，與對照組相比，各添加組采食量、飲水量及日增重都顯著提高，且作用效果具有劑量依賴效應［16］。Suraw-icz［17］研究發(fā)現(xiàn)，LGG可以顯著降低抗生素相關性腹瀉的發(fā)生。Basu等［18］在患急性水樣腹瀉兒童上的研究發(fā)現(xiàn)，使用高劑量LGG可以顯著降低患病兒腹瀉持續(xù)的時間及頻率。以上研究結果與本試驗基本一致。另外，本試驗也發(fā)現(xiàn)，飼糧中LGG補充可在一定程度上緩解RV感染誘導的腹瀉產生，這可能與LGG可提高仔豬抗氧化能力有關。

表5 飼糧中添加LGG和/或RV感染對斷奶仔豬十二指腸、空腸、回腸和血清抗氧化能力的影響Table 5 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the antioxidant capacity in the duodenum，jejunum，ileum and serum in weaned piglets

諸多研究報道，LGG有很強的抗氧化能力。胡曉麗［19］在DSS誘導小鼠結腸炎的研究中發(fā)現(xiàn)，飼喂LGG可以顯著降低結腸髓過氧化物酶(MPO)活性、ROS和MDA水平，提高結腸組織T-AOC和多種抗氧化酶活性。李垚清等［20］探討了多種乳酸菌對MDA的抑制作用，發(fā)現(xiàn)LGG可以明顯抑制MDA生成。王玉華等［21］在鼠李糖乳酸桿菌B10對酒精誘導肝氧化損傷的小鼠上的研究表明，鼠李糖乳酸桿菌B10顯著降低了小鼠肝臟脂肪變性和氧化損傷程度，緩解了小鼠酒精性肝損傷。本研究結果表明，與對照組相比，飼糧添加LGG可以顯著提高仔豬血清和空腸的T-AOC。而本研究也表明飼糧LGG添加可在一定程度上緩解RV感染誘導的仔豬血液和腸道抗氧化能力下降，可以推測LGG緩解RV誘導的仔豬腹瀉與其緩解氧化應激產生的腸道損傷有關。另外，本研究的結果還發(fā)現(xiàn)，雖然飼糧補充LGG緩解RV誘導的T-AOC降低和MDA水平升高，但未緩解RV對T-SOD和GSH-Px活性的影響，因此，可以進一步推測LGG緩解RV誘導的仔豬腸道抗氧化能力下降可能主要是通過非酶抗氧化系統(tǒng)的作用來實現(xiàn)的。

4 結論

飼糧LGG的添加可以顯著降低仔豬的料重比，并可緩解RV感染誘導的斷奶仔豬腹瀉，這可能源于飼糧LGG添加提高了仔豬機體(尤其是腸道)抗氧化能力，抑制脂質過氧化物，維持機體正常氧化還原平衡，繼而增強仔豬的抗病力。

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