強 俊 孫意嵐* 黃 永 楊 弘＊＊ 徐 跑＊＊ 袁慶華何 杰 朱志祥 蘇田平

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，無錫 214081;2.無錫幾丁生物新材料科技發(fā)展有限公司，無錫 2014026;3.江蘇德仁生物科技發(fā)展有限公司，金壇 213200)

當前中國，魚類疾病的預(yù)防與治療主要通過有限的抗生素與化學(xué)藥物，然而，長期使用抗生素會引起病原菌產(chǎn)生抗性，降低藥用效果［1］。伴隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的嚴格限制，大量免疫增強劑和免疫調(diào)控劑得以迅速發(fā)展與推廣，這其中主要包括一些天然物質(zhì)與合成物質(zhì)，如:左旋咪唑、β－葡聚糖、肽聚糖、殼多糖、幾丁聚糖、維生素混合物以及各種中草藥制劑等。這些物質(zhì)可以有效地通過增強細胞與體液的免疫防御來預(yù)防疾?。?］。

甲殼素作為一種天然高分子物質(zhì)，廣泛存在于甲殼類動物、昆蟲與真菌中。在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)行業(yè)的應(yīng)用中，蝦殼與蟹殼是甲殼素及其脫乙酰產(chǎn)物幾丁聚糖(殼聚糖)的重要商業(yè)用料來源［3］。甲殼素與幾丁聚糖可以有效地抑制多種真菌與細菌生長，其調(diào)控原理是幾丁聚糖與細胞表面的負電荷殘基之間的質(zhì)子化氨基(NH2)基團通過靜電力相互作用，從而增強細胞表面的抗菌活性［4］。同時，幾丁聚糖是天然的可生物降解的多糖，也是自然界中唯一帶正電荷的生物活性多糖［5］，通過口服幾丁聚糖來提高免疫力已呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。幾丁聚糖在水產(chǎn)動物上的研究已有一些報道，如飼料中添加幾丁聚糖可以在一定程度上提高褐石斑魚(Epinephelus bruneus)［2］、鯉魚(Cyprinus carpio)［6］、軍 曹 魚 (Rachycentron canadum)［1］、草魚(Ctenopharyngodon idellus)［7］、香魚(Plecoglbssus altivelis)［8］、星斑川鰈(Platichthys stellatus)［9］和 異 育 銀 鯽 (Carassius auratus gibelio)［10－11］的免疫力。然而，近年來，隨著幾丁聚糖研發(fā)工藝的發(fā)展，傳統(tǒng)工藝獲取的幾丁聚糖因分子質(zhì)量巨大、聚合度高、吸收率低以及提取工藝成本較高等原因制約了其推廣應(yīng)用。相比之下，通過無拮抗作用的微生物發(fā)酵與酶解產(chǎn)生的新型幾丁聚糖，分子質(zhì)量小［化學(xué)式為(C6H11NO4)n，相對分子質(zhì)量為(161.9)n］，易于吸收。同時，其提取工藝較為簡單，成本較低，安全性已經(jīng)通過日本政府600項農(nóng)藥殘留檢測，毒性低于食鹽［半數(shù)致死量(LD50)＞20 000 mg/kg］［12］。

羅非魚(Oreochromis niloticus)是世界主要養(yǎng)殖魚類之一，近年來，由于高密度養(yǎng)殖、養(yǎng)殖水體污染以及配合飼料營養(yǎng)不均衡等問題，羅非魚感染疾病的幾率大大升高。其中，無乳鏈球菌和海豚鏈球菌引起的羅非魚鏈球菌病，是羅非魚病害中最為棘手的，該病不僅死亡率高，而且死亡速度極快，治療起來極其困難，該疾病給養(yǎng)殖從業(yè)者帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，已經(jīng)成為嚴重制約羅非魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的枷鎖［13－15］。本研究擬以此新型幾丁聚糖為飼料添加劑，通過對照組與不同添加量間的比較，分析飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚生長性能、血常規(guī)與血清生化參數(shù)、頭腎中免疫相關(guān)基因表達的影響;同時，比較海豚鏈球菌感染后的累計死亡率，從而篩選出幾丁聚糖的最適添加量。本研究結(jié)果可以為新型幾丁聚糖在羅非魚飼料中的應(yīng)用與推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興基地自繁的“吉富”品系尼羅羅非魚幼魚，選擇無病無傷、活力強的個體作為試驗用魚。試驗前在室內(nèi)水泥池［水溫(29±1)℃，pH 7.4±0.2］中暫養(yǎng)10 d，自然光周期。暫養(yǎng)期間使用循環(huán)水連續(xù)充氣，每天08:00和15:00各投喂沉水性飼料(粗蛋白質(zhì)含量為29.0%、粗脂肪含量為8.0%)1次，投喂量為體重的8%。

1.2 試驗設(shè)計與分組

首先配制基礎(chǔ)飼料，然后在每千克基礎(chǔ)飼料中分別添加10、20、30和40 mL的幾丁聚糖溶液(購于江蘇德仁生物科技有限公司，幾丁聚糖的有效濃度為0.6%)，另配制成4種試驗飼料，分別用1、2、3和4組表示。幾丁聚糖溶液的具體添加方法為:每種飼料按照基礎(chǔ)飼料配方(表1)分別配制10 kg的飼料后，采用移液槍分別準確地吸取100、200、300和400 mL的幾丁聚糖液體溶液，先將幾丁聚糖溶液添加至水中，混勻后，然后用噴壺均勻噴灑到飼料中。同時設(shè)置不添加幾丁聚糖的基礎(chǔ)飼料為對照組。將各飼料使用飼料制粒機制成顆粒，陰涼處風(fēng)干，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在封閉的水循環(huán)系統(tǒng)中進行，選取15個容積800 L的塑料桶，每個塑料桶添加曝氣3 d后的自來水700 L。利用控溫系統(tǒng)將溫度保持在(29.0±0.3)℃，試驗開始前對幼魚的體重進行測量，試驗用魚平均體重為(2.97±0.02)g，隨機分為5組，每組3個重復(fù)(塑料桶)，每個重復(fù)放養(yǎng)25尾魚。各組試驗魚初始體重沒有顯著差異(P＞0.05)。每組試驗魚隨機飼喂1種飼料，每次投喂量為體重的5% ～8%，每周投喂6 d，停飼1 d，試驗周期共計63 d。試驗期間連續(xù)充氣，采用虹吸法清除桶底糞便，每隔3 d換水1/3，保持換水前后溫差不超過±0.5℃，溶氧保持在5 mg/L以上，pH 7.6±0.2，氨氮和亞硝酸鹽濃度分別不高于 0.003 和0.004 mg/L，自然光周期。

1.4 生長性能指標測定

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，統(tǒng)計各養(yǎng)殖桶的魚尾數(shù)，稱取每桶魚的總重后，隨機選取5尾魚，用濃度為200 mg/L的MS－222進行快速深度麻醉，分別稱體重后，立即剖開腹腔，剝離出內(nèi)臟和肝臟并稱重。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

分別按下式計算特定生長率(specific growth rate，SGR)、飼料效率(feed efficiency，F(xiàn)E)、成活率(survival ratio，SR)、肝體比(hepatosomatic index，HSI)、內(nèi)臟比(viscerasomatic index，VSI):

式中:W0為魚的初始均體重(g);Wt為魚的終末均體重(g);t為飼養(yǎng)天數(shù)(d);F為每尾魚的平均總攝食量(濕重，g);N0為初始魚尾數(shù);Nt為終末魚尾數(shù);Wh為每尾魚終末肝臟重(g);Wv為每尾魚終末內(nèi)臟重(g);Wb為每尾魚終末體重(g)。

1.5 采樣與處理

每個養(yǎng)殖桶隨機再選取4尾魚，為了降低取樣應(yīng)激，利用過量的MS－222(2%)深度麻醉后，取頭腎與血液樣品檢測相關(guān)指標的變化。一部分血樣用于血常規(guī)指標的檢測，一部分血樣于4℃冰箱中靜置2 h，在4℃、3 500 r/min下離心10 min制備血清，上清液移置－70℃冰箱中保存?zhèn)溆?頭腎樣品用液氮速凍后，于－70℃保存，用于分子生物學(xué)分析。

1.5.1 血常規(guī)指標的測定

血常規(guī)中紅細胞(red blood cells，RBC)、白細胞(white blood cells，WBC)數(shù)目，血紅蛋白(haemoglobin，Hb)濃度與紅細胞壓積(haematocrit，Hct)在邁瑞B(yǎng)C－5300Vet全自動五分類動物血液細胞分析儀上測定，試劑盒均購自無錫中潤醫(yī)藥有限公司。

1.5.2 血清生化指標的測定

血清皮質(zhì)醇(cortisol，COR)含量及溶菌酶(lysozyme，LZM)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，通過BioTek EonTM微孔板分光光度計進行讀數(shù)，試劑盒購自上海朗頓生物有限公司。血清總蛋白(total protein，TP)、葡萄糖(glucose，GLU)、甘油三酯(triglyceride，TC)、膽固醇(cholesterol，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性在邁瑞全自動生化分析儀(BS－400)上測定，試劑盒均購自無錫中潤醫(yī)藥有限公司。

1.5.3 頭腎免疫相關(guān)基因定量表達

根據(jù)GenBank中羅非魚白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)的序列，設(shè)計3個基因的特異性引物，引物序列見表2。用羅非魚的 β－肌動蛋白(β-actin)(EU887951.1)作為內(nèi)參基因，設(shè)計β-actin引物，引物序列見表2。所有引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，取羅非魚頭腎20 mg左右，參照RNeasy Mini Handbook(QIAGEN公司)說明書用試劑盒提取總RNA，所得總RNA的OD260/OD280為1.90左右。熒光定量PCR反應(yīng)液的制備與反應(yīng)條件參照Qiang等［13］的方法。

在基因表達與β-actin的定量PCR擴增效率基本一致的前提下，計算目的基因mRNA相對表達量。以羅非魚β-actin為內(nèi)參，對得到的各樣品Ct值進行均一化處理，以對照組的相對表達量為基準，應(yīng)用 2－ΔΔCt法［16］確定不同幾丁聚糖添加水平下各基因mRNA的相對表達量。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.6 感染試驗

為了減少取樣應(yīng)激，試驗結(jié)束繼續(xù)飼養(yǎng)10 d后，每個養(yǎng)殖桶選取10尾魚進行海豚鏈球菌感染試驗，海豚鏈球菌的培養(yǎng)與計數(shù)、菌液注射感染等方法參照Qiang等［13］的方法。正式感染試驗前，隨機選取30尾備用吉富羅非魚(攝食對照組飼料)，通過感染不同濃度梯度的菌液進行預(yù)試驗，確定感染菌液的半數(shù)致死量。本試驗注射感染所用的海豚鏈球菌菌液濃度為6.15×106CFU/mL，注射劑量為每100 g體重300μL，計算感染192 h時各組的累計死亡率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及Duncan氏法多重比較，顯著水平為P＜0.05。結(jié)果用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響見表3。2組的終末體重和FE均顯著高于對照組與3和4組(P＜0.05)。各組SGR無顯著差異(P＞0.05)。各組 63 d的 SR介于93.3% ～97.3%，組間無顯著差異(P＞0.05)。與對照組相比，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著降低 HSI(P＜0.05)，幾丁聚糖溶液添加量為20和40 mL/kg時能顯著降低VSI(P＜0.05)。

2.2 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響

飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響見表4。與對照組相比，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著增加血液中RBC和WBC數(shù)目以及Hb濃度和Hct(P＜0.05);繼續(xù)增加幾丁聚糖溶液的添加量后各血常規(guī)指標均有所下降。4組中血液中RBC數(shù)目、Hb濃度和Hct與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，但其血液中WBC數(shù)目顯著低于其他各組(P＜0.05)。

2.3 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響

飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響見表5。1、2組血清COR含量顯著低于對照組和4組(P＜0.05)。1組血清 LZM活性顯著高于對照組及 2、3、4 組(P＜0.05)。1、2、3和4組血清SOD活性均顯著高于對照組(P＜0.05)。2組血清 ALT、AST活性及 GLU和 TG含量均較低，顯著低于對照組及1組(P＜0.05)。各組血清TP含量無顯著差異(P＞0.05)。3與4組血清TC含量顯著低于對照組及1和2組(P＜0.05)。1、2和4組血清AKP活性顯著高于3組(P＞0.05)。同時，2組血清LDL-C含量顯著低于其他各組(P＜0.05)，而血清HDL-C含量則顯著高于3和4組(P＜0.05)。

表3 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響Table 3 Effects of chitosan supplementation on growth performance of juvenile GIFT tilapia

表4 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響Table 4 Effects of chitosan supplementation on hematological parameters of juvenile GIFT tilapia

2.4 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚頭腎中免疫相關(guān)基因表達的影響

由圖 1可知，1和2組頭腎 IL-1β和 TNF-α mRNA相對表達量均顯著高于對照組和4組(P＜0.05)。1組頭腎IFN-γmRNA相對表達量顯著高于其他各組(P＜0.05)，隨著幾丁聚糖溶液添加量的增加，IFN-γmRNA相對表達量呈下降趨勢。

2.5 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚感染海豚鏈球菌192 h后累計死亡率的影響

飼喂63 d后，采用6.15×106CFU/mL的海豚鏈球菌菌液進行腹腔注射感染，192 h后累計死亡率結(jié)果見圖2。1、2和3組的累計死亡率介于30.06% ～39.95%，顯著低于對照組的 51.19%與4 組的 77.55%(P＜0.05)。

3 討論

3.1 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

飼料中添加幾丁聚糖對水產(chǎn)動物生長的影響已見一些報道，不同魚類之間存在較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加幾丁聚糖可以提高鯉魚［6］與牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生長速度［17］。然而，Kono等［18］發(fā)現(xiàn)，飼料中添加幾丁聚糖對真鯛(Pagrosomus major)、日本鰻(Anguilla japonica)與 魚(Seriola quinqueracliata)的生長無影響。關(guān)于羅非魚方面的研究僅見Shiau等［19］的報道。Shiau等［19］發(fā)現(xiàn)飼料中添加2% ～10%的幾丁聚糖能夠明顯抑制奧尼羅非魚(O.niloticus×O.aureus)的生長。這可能與從蝦殼、蟹殼獲取的幾丁聚糖分子質(zhì)量巨大、聚合度高、吸收率低，從而制約添加效果有關(guān)。本試驗添加的無拮抗作用的微生物發(fā)酵產(chǎn)生的小分子質(zhì)量幾丁聚糖，具有較高的吸收與利用率。當飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時，63 d后，吉富羅非魚幼魚的生長速度與FE顯著高于對照組，可能是因為適量的幾丁聚糖有助于增加微生物合成，提高酶的活力，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化與吸收［20］，從而提高了生長與飼料利用。然而，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時明顯抑制了吉富羅非魚生長，說明過量的幾丁聚糖可能會影響腸道對于飼料脂肪的消化與吸收，使脂肪通過糞便而排泄到體外［19］。同時，本試驗中發(fā)現(xiàn)，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著降低吉富羅非魚的HSI與VSI，這在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中具有重要的應(yīng)用前景。

3.2 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血常規(guī)指標的影響

本試驗中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著提高吉富羅非魚幼魚血液RBC數(shù)目。血液RBC數(shù)目的升高可能與魚體的營養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。適量的幾丁聚糖有助于提高魚體的消化與代謝反應(yīng)速率，增加氧氣需要量，從而導(dǎo)致 RBC數(shù)目與 Hb濃度的升高［13］。同時，10 mL/kg添加量下血液WBC數(shù)目顯著高于其他組，這與Lin等［21］的研究結(jié)論相似，說明飼料中添加幾丁聚糖有助于提高魚體的非特異性免疫力。然而，幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時血液RBC數(shù)目、Hb濃度和Hct與對照組相比無顯著差異，同時，其血液WBC數(shù)目顯著低于對照組。這說明過量的幾丁聚糖可能會影響細胞代謝與免疫調(diào)控，從而影響了血液中RBC、WBC數(shù)目及Hb濃度與 Hct。

3.3 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響

魚類通過調(diào)節(jié)能量代謝水平來適應(yīng)環(huán)境變化。應(yīng)激狀態(tài)下，為了生長與繁殖，魚體往往需要通過加強代謝活動來維持生理平衡。急性與慢性應(yīng)激均與代謝率的提高相關(guān)聯(lián)［22］。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時能顯著降低血清COR含量，增加生長速度，這可能與魚體的代謝率降低有關(guān)。然而，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時血清COR含量顯著高于添加量為10 mL/kg時，說明過量的幾丁聚糖可能會引起魚體產(chǎn)生代謝壓力，提高代謝率。

圖1 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚頭腎IL-1β、TNF-α和IFN-γmRNA相對表達量的影響Fig.1 Effects of chitosan supplementation on IL-1β，TNF-α and IFN-γ mRNA relative expression levels in head kidney of juvenile GIFT tilapia

圖2 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚感染海豚鏈球菌192 h后累計死亡率的影響Fig.2 Effects of chitosan supplementation on cumulative mortality of juvenile GIFT against Streptococcus iniae after 192 h

LZM具有殺菌活性，能夠作為一種調(diào)理素激活機體的補體系統(tǒng)與吞噬細胞，從而防止病害入侵［6］。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中幾丁聚糖添加量為10 mL/kg時血清LZM活性顯著高于對照組。Geng 等［1］、Gopalakannan 等［6］和常青等［23］也得出類似結(jié)論。血清SOD活性同樣也是一個重要的非特異性免疫指標。本試驗中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時血清SOD活性顯著高于對照組。Lin等［21］在鯉魚研究中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)論。因此，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10～20 mL/kg時能夠顯著降低吉富羅非魚幼魚血清COR含量，提高血清LZM和SOD活性。

血清中ALT與AST活性可以作為肝臟損傷的重要指示物［24］，本研究中發(fā)現(xiàn)飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時血清ALT、AST活性顯著低于對照組，說明飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時能夠起到保護肝臟的作用。血清中GLU含量是魚類面對脅迫時代謝調(diào)控的重要指示物。擁擠與溫度脅迫、病菌感染等均能增加吉富羅非魚血清 GLU 含量［15，22，24］。本研究中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時血清GLU含量顯著低于對照組，這與其相應(yīng)較低的血清COR含量相一致。血清中TG含量的變化反映了魚體脂肪代謝水平，TG含量升高表明肝臟中脂肪沉積較多，容易引起脂肪肝。本研究中發(fā)現(xiàn)飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時血清TG含量顯著低于對照組，說明適量的幾丁聚糖能提高飼料中脂肪的利用［25］。然而，隨著飼料中幾丁聚糖溶液添加量的增加，魚體的脂肪代謝能力下降，血清TG與HSI均出現(xiàn)上升。

本研究中，各組血清TP指標未出現(xiàn)顯著變化，可能是因為這個指標在血液中相對穩(wěn)定，在本試驗處理下不足以產(chǎn)生明顯改變。AKP是一種溶酶體酶，廣泛存在于各組織細胞中，參與水產(chǎn)動物骨骼礦化與細胞膜轉(zhuǎn)運［24］。血清中AKP活性的增加與促進成骨細胞活性、膽汁郁積或慢性脅迫相關(guān)聯(lián)［26］。飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時有較高的血清AKP活性，可能歸因于吉富羅非魚較快的生長速度;然而，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時有較高的血清AKP活性則與魚體在慢性脅迫下代謝紊亂有關(guān)。LDL-C和HDL-C屬于血脂蛋白，血清LDL-C含量升高易引起TG在血管沉積，并與其他物質(zhì)一起堵塞血管;而HDL-C能將肝臟外的TG運輸?shù)礁闻K分解排出體外［27］。本研究中，飼料中幾丁聚糖溶液添加量為40 mL/kg時，吉富羅非魚幼魚血清TG與LDL-C含量均顯著高于添加量為20 mL/kg時，而血清HDL-C含量則顯著低于添加量為20 mL/kg時，表明過量的幾丁聚糖可能導(dǎo)致魚體脂質(zhì)代謝紊亂與血脂沉積。

3.4 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚頭腎中免疫相關(guān)基因表達的影響

隨著病害發(fā)生與防治研究的進一步深入，許多細胞因子基因的功能研究已廣泛開展。在魚類中，IL-1β、TNF-α 和 IFN-γ 作為重要的免疫調(diào)控細胞因子基因，在機體非特異性免疫方面發(fā)揮著重要作用［28］。關(guān)于幾丁聚糖對魚體細胞因子的研究尚未見到相關(guān)報道，僅在雞［29］與小鼠［30－31］上見到類似研究。殼聚糖是以幾丁聚糖為原料，經(jīng)生物技術(shù)降解而成的低分子質(zhì)量產(chǎn)品。張小邊［30］與紀瑩［31］研究均發(fā)現(xiàn)，飼料中添加殼聚糖后，能夠顯著增強小鼠巨噬細胞IL-1β和TNF-α基因的表達，提高機體的非特異性免疫力。王紅衛(wèi)等［29］也報道，飼料中添加200 mg/kg分子質(zhì)量為3 ku的殼聚糖能顯著提高蛋雞脾臟白細胞介素－2(IL-2)和TNF-αmRNA表達水平。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加10 mL/kg含小分子質(zhì)量幾丁聚糖的幾丁聚糖溶液能顯著提高吉富羅非魚頭腎IL-1β、TNF-α和 IFN-γmRNA的相對表達量，這該組較高的WBC數(shù)目及血清LZM與SOD活性等相一致。

3.5 飼料中添加幾丁聚糖對吉富羅非魚幼魚感染海豚鏈球菌192 h后累計死亡率的影響

不同幾丁聚糖添加量下，吉富羅非魚幼魚飼養(yǎng)63 d后，采用6.15×106CFU/mL的海豚鏈球菌菌液進行腹腔注射感染。192 h后，添加量為10 mL/kg的組累計死亡率最低，其次是添加量為20 mL/kg的組。這與前面討論中提及的幾丁聚糖溶液添加量為10、20 mL/kg時具有較高的血清與頭腎非特異性免疫活性相一致。本試驗中添加的幾丁聚糖是通過微生物發(fā)酵后提取的，具有分子質(zhì)量小、溶解性與吸收性較好等優(yōu)勢，因此作用效果更明顯。

4 結(jié)論

①飼料中幾丁聚糖溶液添加量為20 mL/kg時可以促進吉富羅非魚幼魚生長，提高FE，減少肝臟損傷與血清TG含量，有利于健康養(yǎng)殖。

②飼料中幾丁聚糖溶液添加量為10和20 mL/kg時有助于提高血液 WBC數(shù)量、血清LZM和SOD活性，上調(diào)頭腎細胞免疫因子的表達，降低海豚鏈球菌感染后的累計死亡率。

③本試驗條件下，建議吉富羅非魚幼魚飼料中幾丁聚糖溶液的添加量為10～20 mL/kg。

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