袁 威 任志華 鄧又天 鄧慧丹 鄧俊良* 胡 洋

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014;2.四川華德生物工程有限公司，成都 610000)

現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中，大多數(shù)仔豬在3～4周齡斷奶，但是仔豬的免疫功能在7周齡左右才成熟［1］。在這個(gè)特殊時(shí)期，一些病毒(如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等)病可導(dǎo)致仔豬高發(fā)病率和高死亡率，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何提高斷奶仔豬的免疫功能是很重要的問(wèn)題。

抗菌肽(AMP)是幾十個(gè)氨基酸殘基組成的小肽。它是從各種植物、動(dòng)物、組織和細(xì)胞分離、提取和純化出來(lái)的具有生物活性的物質(zhì)［2］，具有廣泛的功能，包括抗菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、抗寄生蟲和提高免疫功能等［3-8］。已有研究表明，飼糧中添加抗菌肽能提高小鼠［9］、肉兔［10］、雞［11-12］和斷奶仔豬的免疫功能［13-15］。但目前關(guān)于復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量影響的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)在前人試驗(yàn)［13-15］的基礎(chǔ)上，研究飼糧中復(fù)合抗菌肽水平對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能及血清細(xì)胞因子［白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)］含量的影響，初步探討復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬機(jī)體免疫的調(diào)控機(jī)制，為今后復(fù)合抗菌肽在豬業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用復(fù)合抗菌肽由四川華德生物工程有限公司提供，由豬防御素(37個(gè)氨基酸)和蒼蠅抗菌肽(40個(gè)氨基酸)混合而成，各占50%;試驗(yàn)用黃芪多糖純度大于65%，由北京生泰爾生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物為26日齡斷奶的杜×長(zhǎng)×大三元雜交仔豬;基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1998)豬的營(yíng)養(yǎng)需要以及試驗(yàn)豬場(chǎng)的飼糧配方，配制成全價(jià)粉狀料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

將90頭平均體重約為8.28 kg的仔豬按體重相近、公母各占1/2的原則隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭豬。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧;Ⅱ～Ⅴ組為試驗(yàn)組，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg黃芪多糖，250、500和1 000 mg/kg復(fù)合抗菌肽。

試驗(yàn)前對(duì)豬舍進(jìn)行消毒，仔豬于21日齡斷奶，預(yù)飼5 d后進(jìn)行正式試驗(yàn)，試驗(yàn)期28 d，試驗(yàn)豬采用群飼，飼喂干粉料，日喂3次，每次以吃飽略剩料為宜，自由飲水。其他飼養(yǎng)管理措施和免疫接種按豬場(chǎng)的常規(guī)程序進(jìn)行。

1.4 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

每周進(jìn)行1次結(jié)料，準(zhǔn)確稱取飼料重，記錄各組仔豬的耗料量;分別于試驗(yàn)第7天(32日齡)、第14天(39日齡)、第21天(46日齡)和第28天(53日齡)進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算各組的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5 血清細(xì)胞因子含量測(cè)定

在試驗(yàn)第7天(32日齡)、第14天(39日齡)、第21天(46日齡)和第28天(53日齡)，分別從各重復(fù)隨機(jī)選取2頭試驗(yàn)豬前腔靜脈采集血2 mL，靜置后于3 000 r/min離心15 min制備血清，-20℃ 保 存。血 清 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 和TNF-α含量的測(cè)定均按武漢基因美生物科技有限公司所生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書操作。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的前處理，用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較用Duncan氏法進(jìn)行。除料重比外，其他數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

從表2可知，在整個(gè)試驗(yàn)期間，除33～39日齡Ⅱ組(黃芪多糖組)平均日采食量低于對(duì)照組外，其余日齡段各試驗(yàn)組均高于對(duì)照組，但均差異不顯著(P＞0.05)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組仔豬平均日增重均高于對(duì)照組，除33～39日齡Ⅱ、Ⅲ組和40～46日齡Ⅲ組與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)外，其余日齡段各試驗(yàn)組均顯著或極顯著高于對(duì)照組(P＜0.05 或 P＜0.01);除 47～53 日齡Ⅴ組平均日增重高于Ⅱ組但差異不顯著(P＞0.05)外，其余日齡段Ⅴ組均極顯著高于Ⅱ組(P＜0.01)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組料重比均低于對(duì)照組;Ⅱ組和Ⅲ組較為接近，但Ⅳ和Ⅴ組均低于Ⅱ組;復(fù)合抗菌肽組(Ⅲ～Ⅴ組)料重比呈劑量依賴性降低。

表2 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of complex antibacterial peptide on growth performance of weaned piglets

2.2 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清 IL-2含量的影響

由表3可知，在各采樣日齡，各試驗(yàn)組仔豬血清IL-2含量均高于對(duì)照組。在32日齡，Ⅴ組血清IL-2含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);在39日齡，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ組血清IL-2含量均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);在46和53日齡，各試驗(yàn)組血清IL-2含量均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。Ⅲ組血清IL-2含量在除32日齡外的各日齡均極顯著低于Ⅱ組(P＜0.01);Ⅳ組血清IL-2含量在除32日齡外的各日齡均略高于Ⅱ組，但差異不顯著(P＞0.05);Ⅴ組血清IL-2含量在各日齡均顯著或極顯著高于Ⅱ組(P＜0.05 或 P＜0.01)。復(fù)合抗菌肽組仔豬血清IL-2含量呈劑量依賴性升高。

2.3 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清 IL-4含量的影響

由表4可知，除32日齡各組仔豬血清IL-4含量差異不顯著(P＞0.05)外，各試驗(yàn)組血清IL-4含量在39、46、53日齡均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。Ⅲ組血清IL-4含量在除32日齡外的各日齡均極顯著低于Ⅱ組(P＜0.01);Ⅳ組血清IL-4含量在53日齡顯著高于Ⅱ組(P＜0.05);Ⅴ組血清IL-4含量在除32日齡外的各日齡均顯著或極顯著高于Ⅱ組(P＜0.05 或 P＜0.01)。復(fù)合抗菌肽組仔豬血清IL-4含量呈劑量依賴性升高。

2.4 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清 IL-6含量的影響

由表5可知，除Ⅲ組仔豬血清IL-6含量在32日齡高于對(duì)照組但差異不顯著(P＞0.05)外，各試驗(yàn)組血清IL-6含量在各日齡均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。Ⅲ組血清IL-6含量在32和53日齡顯著或極顯著低于Ⅱ組(P＜0.05 或 P＜0.01);Ⅳ和Ⅴ組血清IL-6含量在各日齡均顯著或極顯著高于Ⅱ組(P＜0.05 或 P＜0.01)。復(fù)合抗菌肽組仔豬血清IL-6含量呈劑量依賴性升高。

表3 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清IL-2含量的影響Table 3 Effects of complex antibacterial peptide on serum IL-2 content of weaned piglets ng/L

表4 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清IL-4含量的影響Table 4 Effects of complex antibacterial peptide on serum IL-4 content of weaned piglets ng/L

表5 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清IL-6含量的影響Table 5 Effects of complex antibacterial peptide on serum IL-6 content of weaned piglets ng/L

2.5 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清IFN-γ含量的影響

由表6可知，各試驗(yàn)組血清IFN-γ含量在各日齡均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。Ⅲ組血清IFN-γ含量在各日齡均極顯著低于Ⅱ組(P＜0.01);除Ⅳ組血清IFN-γ含量在46日齡高于Ⅱ組但差異不顯著(P＞0.05)外，Ⅳ和Ⅴ組血清 IFN-γ含量在各日齡均極顯著高于Ⅱ組(P＜0.01)。復(fù)合抗菌肽組仔豬血清IFN-γ含量呈劑量依賴性升高。

表6 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清IFN-γ含量的影響Table 6 Effects of complex antibacterial peptide on serum IFN-γcontent of weaned piglets ng/L

2.6 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清TNF-α含量的影響

由表7可知，除Ⅱ組仔豬血清TNF-α含量在39日齡以及Ⅲ組仔豬血清TNF-α含量在32、39、46日齡高于對(duì)照組但差異不顯著(P＞0.05)外，各試驗(yàn)組血清TNF-α含量在各日齡均顯著或極顯著高 于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。Ⅲ組血清TNF-α含量在46和53日齡極顯著低于Ⅱ組(P＜0.01);Ⅳ組血清TNF-α含量在各日齡均高于Ⅱ組，但差異不顯著(P＞0.05);Ⅴ組血清 TNF-α 含量在各日齡均顯著或極顯著高于Ⅱ組(P＜0.05或P＜0.01)。復(fù)合抗菌肽組仔豬血清TNF-α含量呈劑量依賴性升高。

表7 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清TNF-α含量的影響Table 7 Effects of complex antibacterial peptide on serum TNF-αcontent of weaned piglets ng/L

3 討論

3.1 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

研究表明，抗菌肽能有效促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，從而改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能［16-19］?？咕闹饕峭ㄟ^(guò)殺滅動(dòng)物腸道中的有害菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善腸絨毛長(zhǎng)度，提高黏膜厚度和腸絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值，從而改善小腸黏膜消化結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)消化吸收功能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加400 mg/kg黃芪多糖能提高斷奶仔豬的平均日采食量和平均日增重，降低料重比，這與Yuan等［20］用100～1 000 mg/kg黃芪多糖飼喂斷奶仔豬的研究結(jié)果一致;飼糧中分別添加 250、500、1 000 mg/kg復(fù)合抗菌肽均能有效提高斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重，并降低料重比，這與張勇軍［21］和王阿榮［22］分別在斷奶仔豬飼糧中添加150、300、450 mg/kg 天蠶素抗菌肽和 180、250、320 mg/kg天蠶素抗菌肽的研究結(jié)果一致。此外，1 000 mg/kg復(fù)合抗菌肽的促生長(zhǎng)效果明顯優(yōu)于400 mg/kg黃芪多糖。

3.2 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響

細(xì)胞因子是由造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或炎癥反應(yīng)中的活化細(xì)胞產(chǎn)生的高活性多功能的多肽、功能蛋白或糖蛋白，在機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、造血、組織修復(fù)及胚胎發(fā)生和生長(zhǎng)發(fā)育等諸方面起著關(guān)鍵作用。機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子之間構(gòu)成的“細(xì)胞因子微環(huán)境”或“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”的失衡，常常與疾病的發(fā)生相關(guān)［23］。IL-2為輔助性T(Th)1型細(xì)胞因子，對(duì)于機(jī)體的免疫應(yīng)答起著重要的作用。IL-2的生物活性非常廣泛:誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生干擾素;增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷活性;刺激已活化的B細(xì)胞增殖，促進(jìn)免疫球蛋白(Ig)M和IgG的分泌;激活Th細(xì)胞再次釋放多種輔助因子，以擴(kuò)大免疫應(yīng)答;可促使外周血單核細(xì)胞釋放IFN-γ 和 TNF-α、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)［24-25］。IL-4主要由活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞合成和分泌，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞也可少量合成［26］。IL-4在調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的分化、活化，以及在促進(jìn)以Th2細(xì)胞為特征的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用［27］。血液中IL-6主要來(lái)源于活化的單核細(xì)胞，而局部組織中的IL-6則主要由成纖維細(xì)胞或局部巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分化;促進(jìn)漿細(xì)胞產(chǎn)生IgG、IgM和IgA，在T細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)生和白介素-2受體(IL-2R)的表達(dá)［28］。IFN-γ主要由細(xì)胞細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞殺死病原微生物，促進(jìn)其他細(xì)胞(CTL、NK細(xì)胞等)發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)皮膚、黏膜的上皮細(xì)胞凋亡［29-30］;IFN-γ還在Th1型反應(yīng)過(guò)程中充當(dāng)重要角色，調(diào)節(jié)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ型和Ⅱ型蛋白的表達(dá)和抗原呈遞;IFN-γ還抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，但是可通過(guò)誘導(dǎo)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡來(lái)控制免疫反應(yīng)進(jìn)程［31］。TNF-α主要由機(jī)體多種細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞和成骨細(xì)胞等)產(chǎn)生和釋放［32］。TNF-α可促進(jìn) T細(xì)胞及其他NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性;作為一種重要的炎癥遞質(zhì)，在啟動(dòng)和維持腸組織炎癥中起著非常重要的作用［33］。

體外試驗(yàn)表明，人α-防御素能刺激小鼠脾臟細(xì)胞增殖并促進(jìn)其分泌 IL-4、IFN-γ［34］，人抗菌肽能通過(guò)刺激先天性免疫細(xì)胞釋放白介素-1β(IL-1β)［35］，并能協(xié)同 IL-1β 促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6、白介素-10(IL-10)和趨化因子［36］。而 Hancock 等［37］則 認(rèn) 為 昆 蟲 抗 菌 肽CEMA能夠抑制RAW細(xì)胞中白介素-15(IL-15)的表達(dá)。體內(nèi)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能提高雞脾臟IL-2 mRNA的表達(dá)量，其中200和400 mg/kg抗菌肽組能顯著提高其表達(dá)量;劉莉如等［38］研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素抗菌肽能抑制蛋用仔公雞空腸組織中前炎性細(xì)胞因子基因mRNA的表達(dá)，其中200、250、300和350 mg/kg抗菌肽均顯著抑制IL-6和IFN-γmRNA的相對(duì)表達(dá)水平，300和350 mg/kg抗菌肽顯著抑制TNF-αmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。有關(guān)復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明:飼糧中添加400 mg/kg黃芪多糖能提高斷奶仔豬血清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 和 TNF-α 的 含 量，這 與 Yuan等［20］試驗(yàn)得出的在飼糧中添加 324～563 mg/kg黃芪多糖能顯著提高斷奶仔豬血清中IL-2和IFN-γ的含量(試驗(yàn)期21 d)相一致;而其得出的對(duì)血清中IL-4含量無(wú)顯著影響的結(jié)果則與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與飼喂黃芪多糖的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān);飼糧中分別添加250、500、1 000 mg/kg復(fù)合抗菌肽均能有效提高斷奶仔豬血清 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量，以Ⅴ組效果最為明顯，即復(fù)合抗菌肽添加量為1 000 mg/kg時(shí)效果最好，且添加500、1 000 mg/kg復(fù)合抗菌肽時(shí)對(duì)血清細(xì)胞因子含量的提高效果優(yōu)于400 mg/kg黃芪多糖。這表明復(fù)合抗菌肽能通過(guò)提高血清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量來(lái)提高斷奶仔豬的免疫功能。

4 結(jié) 論

飼糧中添加復(fù)合抗菌肽能提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，并提高斷奶仔豬血清 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量，從而提高斷奶仔豬的免疫功能，以添加量為1 000 mg/kg時(shí)效果較好。

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