周映華 胡新旭* 卞 巧 劉惠知 王升平高書鋒,4 周小玲 張德元 郭照輝
(1.湖南省微生物研究院,長(zhǎng)沙 410009;2.飼用微生態(tài)制劑湖南省工程實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410009;3.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410127;4.湖南省農(nóng)用微生物應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,長(zhǎng)沙 410009)
目前飼料安全等同于食品安全的概念在世界范圍內(nèi)已成為共識(shí)。新型、綠色、無(wú)公害微生物固體發(fā)酵飼料成為未來(lái)飼料行業(yè)的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。目前發(fā)酵雜粕和其他發(fā)酵原料在豬方面的應(yīng)用研究報(bào)道相對(duì)較多,而微生物發(fā)酵全價(jià)飼料,特別是微生物發(fā)酵不含抗生素的全價(jià)飼料在仔豬-生長(zhǎng)豬-育肥豬全階段使用的報(bào)道很少。因此,本試驗(yàn)在4個(gè)不同處理(不含抗生素發(fā)酵全價(jià)飼料添加量分別為0、10%、20%和30%)對(duì)斷奶保育階段仔豬進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,挑選了對(duì)照組和最佳劑量發(fā)酵全價(jià)飼料添加組(20%),剔除少數(shù)豬只消除本次試驗(yàn)起始平均頭重差異,進(jìn)一步研究了復(fù)合益生菌無(wú)抗發(fā)酵飼糧與含抗生素飼糧對(duì)生長(zhǎng)肥育豬(20~110 kg)全階段生長(zhǎng)性能、腸道菌群和消化性能的影響,為研發(fā)安全、高效環(huán)保無(wú)抗發(fā)酵飼糧并成熟應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
試驗(yàn)用復(fù)合益生菌制劑由湖南省微生物研究院研制并提供,活菌數(shù)≥2×109CFU/mL。復(fù)合益生菌制劑主要成分為乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌等。無(wú)抗發(fā)酵飼料的底物為全價(jià)生長(zhǎng)育肥豬配合粉料,發(fā)酵時(shí)添加菌液、水和無(wú)抗全價(jià)飼料的質(zhì)量百分比例分別為5%、35%和60%。每個(gè)星期做1次發(fā)酵飼料,發(fā)酵時(shí)間3~7 d;飼料發(fā)酵3 d以上可以使用。飼料接種發(fā)酵液菌種混勻后使用帶呼吸膜的尼龍袋密封包裝,保證發(fā)酵的正常進(jìn)行和飼料不變質(zhì)。一個(gè)批次的發(fā)酵飼料一般要求在15 d內(nèi)用完。
將60頭18 kg左右的“杜洛克×長(zhǎng)白×大白”雜交保育仔豬隨機(jī)分成2個(gè)組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10頭仔豬。試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,對(duì)照組以豬場(chǎng)飼喂的含抗生素常規(guī)飼糧為基礎(chǔ)飼糧(每千克含黃霉素5 mg),試驗(yàn)組以80%不含抗生素的基礎(chǔ)飼糧和20%的無(wú)抗發(fā)酵全價(jià)飼料組成試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)于2012年8月18日至2013年1月22日在湖南恒惠農(nóng)牧有限公司豬場(chǎng)進(jìn)行。
為了試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便起見(jiàn),兼顧生長(zhǎng)豬和育肥豬2階段的營(yíng)養(yǎng)需要,采用適中的飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平,整個(gè)試驗(yàn)期使用同一個(gè)基礎(chǔ)飼糧,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。無(wú)抗飼料發(fā)酵前飼料營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)值為:粗蛋白質(zhì) 16.60%,鈣 0.58%,總磷0.49%,無(wú)機(jī)磷0.30%;發(fā)酵7 d后飼料營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)值為:粗蛋白質(zhì) 16.70%,鈣 0.58%,總磷 0.50%,無(wú)機(jī)磷 0.36%,乳酸菌 2.5×109CFU/g,枯草芽孢桿菌 4.5×106CFU/g,酵母菌 5.5×107CFU/g。預(yù)混料來(lái)源于湖南恒惠飼料公司定制產(chǎn)品,對(duì)照組預(yù)混料中添加抗生素,試驗(yàn)組預(yù)混料不添加抗生素,其余與對(duì)照組完全一致。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %
按豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行。預(yù)試期3 d,進(jìn)入正試期后各組分別喂相應(yīng)飼糧。自由采食,自由飲水,按豬場(chǎng)正常程序進(jìn)行免疫。試驗(yàn)期154 d。
1.5.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)
分別于試驗(yàn)的第1天和最后1天08:00空腹逐欄稱重,按照每欄總重和頭數(shù)計(jì)算平均頭重,根據(jù)平均頭重的初重和末重計(jì)算平均日增重。每周記錄各組的采食量,試驗(yàn)結(jié)束后結(jié)算各組消耗飼料,計(jì)算出平均日采食量(試驗(yàn)組按照飼喂基礎(chǔ)量的0.92倍系數(shù)換算成與對(duì)照組同樣的風(fēng)干型飼糧重量)。根據(jù)平均日增重和平均日采食量計(jì)算料重比。
1.5.2 糞樣和腸道菌群檢測(cè)
分別在試驗(yàn)中期和后期采集糞樣,在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每重復(fù)選擇1頭中等體重出欄豬屠宰,屠宰時(shí)進(jìn)行腸道食糜和腸道黏膜取樣,取樣后用塑料樣品袋放置-20℃冰箱保存。采用平板稀釋方法對(duì)樣品中的乳酸菌、大腸桿菌和沙門氏菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。
腸道黏膜取樣方法:從每頭豬的十二指腸、空腸和盲腸腸段取樣5 cm,剪開腸段,用干凈玻璃棒將食糜輕柔分離,用蒸餾水輕緩將附著腸壁上殘留食糜沖洗2~3次,用手術(shù)刀刮取腸道黏膜并在電子分析天平上稱重,稱量記錄該腸段重量,測(cè)量剪開腸段寬度,按照長(zhǎng)乘以寬公式計(jì)算取樣腸段面積,便于計(jì)算每平方厘米和每克黏膜細(xì)菌的含量。
乳酸菌:分別稱取一定量樣品(糞樣和食糜取樣5 g左右,腸道黏膜取樣1 g左右),采用1∶9梯度稀釋法,稀釋至10-6梯度,用微量取液器分別吸取 10-6~10-4梯度稀釋液 1 mL 加入無(wú)菌平皿中,再傾注約20 mL冷卻至45℃的乳酸菌選擇性培養(yǎng)基(MRS),并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻(各稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)),37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以上整個(gè)操作自培養(yǎng)物加入培養(yǎng)皿開始至接種結(jié)束需在20 min內(nèi)完成。
大腸桿菌:用微量取液器分別移取樣品按照10-6~10-4梯度稀釋,稀釋液 1 mL 涂布接種于麥康凱培養(yǎng)基平皿上(各稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)),置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,選取粉紅色或紅色,表面光滑、凸起,邊緣整齊不透明,質(zhì)地軟,直徑1.0~3.0 mm的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),并通過(guò)相應(yīng)生化試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行鑒定。
沙門氏菌:用微量取液器分別吸取不同梯度的樣品稀釋液1.0 mL于培養(yǎng)血中,與冷卻至45℃的沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養(yǎng)基(SS)混合,各稀釋度3次重復(fù),傾注法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[1],37℃培養(yǎng)24 h,檢測(cè)菌體數(shù)。
1.5.3 消化指標(biāo)測(cè)定
試驗(yàn)結(jié)束前,連續(xù)5 d以不完全收糞法采集糞便,每天收糞1次。在豬圈四角和中間5點(diǎn)共采集糞便100 g,加10%H2SO410 mL,攪拌均勻,放置4℃冰箱中備用。測(cè)定前先將糞樣50℃烘至半干,粉碎。按4 mol/L鹽酸不溶灰分指示劑法測(cè)定飼糧的粗蛋白質(zhì)、干物質(zhì)、粗纖維、總鈣和總磷的表觀消化率。酸不溶灰分指示劑法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[2]。無(wú)機(jī)磷測(cè)定是將飼料樣品用鹽酸和硝酸處理,使無(wú)機(jī)磷浸提出來(lái),對(duì)濾液用釩鉬酸銨試劑顯色使用分光光度法測(cè)定,可計(jì)算出無(wú)機(jī)磷含量[3]。
采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。
由表2可見(jiàn),試驗(yàn)組的末重、平均日增重和平均日采食量都顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而料重比則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組比較,試驗(yàn)組平均日增重提高了10.89%,平均日采食量提高了5.86%,料重比降低了4.38%。
表2 無(wú)抗發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of fermented feed without antibiotic on growth performance of growing-finishing pigs
由表3可見(jiàn),2組之間生長(zhǎng)肥育豬糞便中期和后期的乳酸菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值差異顯著(P<0.05);其中試驗(yàn)組中期和后期的乳酸菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而試驗(yàn)組中期和后期的大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
在試驗(yàn)中期階段,試驗(yàn)組乳酸菌數(shù)量為4.44×108CFU/g,比對(duì)照組提高了129.09%;而試驗(yàn)組大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量分別為2.41×106和4.22×105CFU/g,比對(duì)照組分別降低了 89.96%和86.05%。在試驗(yàn)后期階段,試驗(yàn)組乳酸菌數(shù)量為1.24×109CFU/g,比對(duì)照組提高了 383.51%;而試驗(yàn)組大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量分別為2.47×106和5.31×104CFU/g,比對(duì)照組分別降低了 90.25%和98.07%。
表3 無(wú)抗發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)肥育豬糞便中微生物數(shù)量的影響Table 3 Effects of fermented feed without antibiotic on faecal microbial number of growing-finishing pigs lg(CFU/g)
由表4可見(jiàn),在十二指腸腸段,試驗(yàn)組腸道食糜中的乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而2組間沙門氏菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值差異不顯著(P>0.05)。在空腸腸段,2組間腸道食糜中的乳酸菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值差異均不顯著(P>0.05)。在盲腸腸段,2組間腸道食糜中的乳酸菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值差異均不顯著(P>0.05)。
表4 無(wú)抗發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)育肥豬腸道食糜微生物數(shù)量的影響Table 4 Effects of fermented feed without antibiotic on intestine chyme microbial number of growing-finishing pigs lg(CFU/g)
由表5可見(jiàn),在十二指腸腸段,試驗(yàn)組腸道每克和每平方厘米黏膜的乳酸菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值顯著高于對(duì)照組(P<0.05);試驗(yàn)組腸道每克黏膜的大腸桿菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在空腸腸段,試驗(yàn)組腸道每克和每平方厘米黏膜的乳酸菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。除以上5項(xiàng)指標(biāo)以外,2組間在十二指腸、空腸和盲腸腸段上腸道每克和每平方厘米黏膜的乳酸菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值差異均不顯著(P>0.05)。
由表6可見(jiàn),2組之間飼料的干物質(zhì)、總鈣和總磷的表觀消化率差異不顯著(P>0.05),但是從數(shù)值上來(lái)看,試驗(yàn)組的干物質(zhì)、總鈣和總磷的表觀消化率都要稍微高于對(duì)照組。試驗(yàn)組的粗蛋白質(zhì)和粗纖維的表觀消化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),比對(duì)照 組分別提高了4.66%和7.47%。
表5 無(wú)抗發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)育肥豬腸道黏膜微生物數(shù)量的影響Table 5 Effects of fermented feed without antibiotic on intestinal mucosa microbial number of growing-finishing pigs
表6 無(wú)抗發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)肥育豬飼料養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 6 Effects of fermented feed without antibiotic on nutrient apparent digestibility of growing-vfinishing pigs %
本試驗(yàn)中無(wú)抗發(fā)酵飼料采用的復(fù)合微生態(tài)制劑由乳酸菌、釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌按照1∶1∶1比例組成。該發(fā)酵飼料中除了含有一定活菌,還有益生菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶,可以賦予發(fā)酵飼料酸香味,改善適口性,促進(jìn)采食,增加動(dòng)物的消化能力,提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[4]。本試驗(yàn)中,添加20%無(wú)抗發(fā)酵飼料試驗(yàn)組的平均日增重、平均日采食量、料重比明顯優(yōu)于對(duì)照組,與前人的研究報(bào)道基本一致[5-6]。此外還有眾多的研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵飼料可以通過(guò)提高采食量和日增重,降低藥費(fèi)開支來(lái)提高育肥豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益,每頭出欄育肥豬增加的養(yǎng)殖效益在30~180元之間,說(shuō)明應(yīng)用發(fā)酵飼料喂育肥豬經(jīng)濟(jì)效益比較好,方法可行[7-11]。
正常情況下,動(dòng)物腸道內(nèi)各種微生物區(qū)系之間保持著動(dòng)態(tài)的平衡。動(dòng)物的健康水平也和動(dòng)物腸道菌群平衡密切相關(guān)。一旦腸道微生態(tài)平衡被打破,一些致病菌或者條件致病菌如大腸桿菌、沙門氏菌等大量增加,排放內(nèi)毒素和產(chǎn)生其他毒副作用,引起機(jī)體消化機(jī)能紊亂,導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)性能下降[12-13]。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,添加20%無(wú)抗發(fā)酵飼料試驗(yàn)組可以顯著增加生長(zhǎng)育肥階段中期和后期糞便中的乳酸菌數(shù)量,減少糞便中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。由于研究方法和試驗(yàn)條件的局限性,目前眾多的研究者一般都僅僅檢測(cè)豬糞便的微生物菌群數(shù)量變化。由于細(xì)菌定植的特殊性,筆者認(rèn)為排出體外的糞便和體內(nèi)食糜中多為腸道過(guò)路菌,而腸道黏膜上黏附牢固的才是腸道定植菌群的主體,更值得深入研究,但是這方面的檢測(cè)研究報(bào)道較少。因此本試驗(yàn)對(duì)十二指腸、空腸和盲腸部位的腸道食糜及腸道黏膜做了對(duì)比性檢測(cè),具有一定的參考價(jià)值。試驗(yàn)結(jié)果也表明,在不同的腸段位置和不同的體組成成分中(腸道食糜和腸道黏膜),其微生物變化規(guī)律不盡相同。無(wú)抗發(fā)酵飼料可以顯著增加十二指腸食糜以及腸道黏膜的乳酸菌數(shù)量,增加空腸和盲腸的食糜以及黏膜的乳酸菌數(shù)量,這個(gè)結(jié)果和眾多學(xué)者研究結(jié)果基本一致[1,12,14-16]。試驗(yàn)結(jié)果表明,每克腸道食糜和腸道黏膜的乳酸菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量一般比糞便中的數(shù)量低上2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。而且在同一腸段對(duì)于同一種細(xì)菌,如果采用的統(tǒng)計(jì)方式不一樣,其表現(xiàn)出來(lái)的統(tǒng)計(jì)規(guī)律也不完全一致。比如十二指腸黏膜上的大腸桿菌,如果采用每克十二指腸黏膜所含大腸桿菌數(shù)量對(duì)數(shù)值來(lái)統(tǒng)計(jì),結(jié)果是試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組,但是如果采用每平方厘米十二指腸黏膜所含大腸桿菌數(shù)量對(duì)數(shù)值來(lái)統(tǒng)計(jì),結(jié)果是試驗(yàn)組和對(duì)照組差異不顯著。造成這種差異的根本原因是進(jìn)行比較分析的參照系不同(一個(gè)是單位重量所含的微生物數(shù)量,一個(gè)是單位面積內(nèi)所含的微生物數(shù)量),同時(shí)可能與取樣手法以及取樣的位置一致性有關(guān),特別是取樣位置的差異性容易造成試驗(yàn)結(jié)果較大的誤差。
動(dòng)物對(duì)飼料的消化性能越好,對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用效率越高,越有利促進(jìn)生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果中,與對(duì)照組相比,添加20%無(wú)抗發(fā)酵飼料試驗(yàn)組的粗蛋白質(zhì)和粗纖維表觀消化率顯著提高,總鈣和總磷表觀消化率也有所提升,說(shuō)明發(fā)酵飼料可以提高育肥豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率,這方面研究結(jié)果與前人[7,17]一致。發(fā)酵飼料中的益生菌和其產(chǎn)生的消化酶可以將粗蛋白質(zhì)、碳水化合物分解為小肽、游離氨基酸和小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸提高動(dòng)物腸胃消化機(jī)能;此外微生物可以使飼料中非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白提高氨基酸含量和蛋白質(zhì)質(zhì)量[18]。研究發(fā)現(xiàn)飼料經(jīng)過(guò)益生菌發(fā)酵后可以將植酸磷轉(zhuǎn)化為動(dòng)物容易吸收的無(wú)機(jī)磷,提高動(dòng)物對(duì)磷的利用率[17]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料可以提高氮和磷的利用率,減少糞便中氮磷排放,降低生豬排泄物對(duì)環(huán)境的污染,實(shí)現(xiàn)清潔健康養(yǎng)殖。
黃霉素對(duì)短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌都有一定抑制生長(zhǎng)作用,對(duì)大腸桿菌的體外抑制作用不明顯[19-20]。添加黃霉素,可降低仔豬空腸大腸桿菌數(shù)量,但對(duì)乳酸桿菌和盲腸、直腸大腸桿菌數(shù)量無(wú)明顯影響[21]。本試驗(yàn)中,黃霉素對(duì)生長(zhǎng)肥育豬的腸道優(yōu)勢(shì)菌群調(diào)節(jié)效果不如益生菌發(fā)酵飼料,在糞便中黃霉素添加組的大腸桿菌和沙門氏菌病源菌的數(shù)量顯著高于無(wú)抗飼料添加組。由于在當(dāng)前養(yǎng)殖環(huán)境下養(yǎng)豬不可避免需要使用抗生素,大部分規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)殖戶目前還難以做到真正的無(wú)抗健康養(yǎng)殖,建議在實(shí)際養(yǎng)豬生產(chǎn)中可結(jié)合臨床上抗生素保健或用藥停藥一段時(shí)間后再使用無(wú)抗發(fā)酵飼料,發(fā)揮其在恢復(fù)健康菌群和防止多重感染方面的優(yōu)勢(shì),減少長(zhǎng)期使用抗生素帶來(lái)的耐藥性等負(fù)面影響。
本研究中復(fù)合微生態(tài)制劑由3種菌株組成,其中乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌分別為厭氧、好氧、兼性厭氧種類微生物,三者之間生物代謝過(guò)程和代謝產(chǎn)物在飼料固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中可以起到一定相互促進(jìn)作用。酵母菌和枯草芽孢桿菌能快速地消耗氧氣,產(chǎn)生了少量的酒精和乳酸,同時(shí)物料的pH也下降到5.6以下,從而為乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖提供了很好的前提條件。隨著乳酸桿菌數(shù)量不斷增加,物料的pH繼續(xù)下降,一些大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等)不斷降解,而同時(shí)一些有機(jī)酸、多肽、抗菌肽和游離氨基酸的數(shù)量卻在不斷增加,飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到了很大提升。復(fù)合菌劑生產(chǎn)的發(fā)酵飼料能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡,維持腸道正常功能。
綜合各項(xiàng)指標(biāo)來(lái)看,在生長(zhǎng)肥育豬飼糧中添加20%的無(wú)抗發(fā)酵飼料,能提高其生長(zhǎng)性能,改善腸道微生物平衡,提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力。
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動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2015年3期