張 帆 紀(jì)守坤 張乃鋒 姜成鋼 王黎文丁 健 司丙文 屠 焰 刁其玉*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081;2.農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)總站，北京 100026)

近年來，隨著人們生活水平的提高，我國畜牧業(yè)得到了快速的發(fā)展，特別是牛羊類產(chǎn)品也更是供不應(yīng)求，然而蛋白質(zhì)飼料在我國處于嚴(yán)重緊缺狀況，我國目前大豆對外國的依賴度達到80%，反芻動物有特殊的消化器官——瘤胃，瘤胃中生長著大量的微生物，其中部分微生物可將尿素等非蛋白氮(NPN)合成微生物的菌體蛋白(MCP)，供機體利用，為其提供維持與生產(chǎn)的需要［1］，因此尋找可供反芻動物利用的非蛋白氮，并對其安全性做出評價是緩解我國蛋白質(zhì)飼料緊缺的重要途徑。目前可供反芻動物利用的非蛋白氮飼料，最常見的是尿素，然而尿素在瘤胃中的釋放速度較快，而瘤胃內(nèi)微生物的數(shù)量有限，其利用氨合成菌體蛋白的速度較為緩慢，瘤胃中多余的氨一部分進入肝臟轉(zhuǎn)化成尿素隨尿液排出體外，另一部分則進入血液與二氧化碳反應(yīng)生成氨基甲酸，而氨基甲酸會使羊發(fā)生中毒，因此在飼喂尿素時牛羊容易發(fā)生尿素氨中毒。磷酸脲(urea phosphate)中的氨釋放速度低于尿素，相當(dāng)于尿素分解速度的0.25 倍［2］，且磷酸脲中含有磷元素，因此磷酸脲在生產(chǎn)中更有優(yōu)勢，是一種新型、安全的非蛋白氮［3］，在反芻動物飼糧中是較為理想的非蛋白氮飼料添加劑，低毒性［4］，無致畸變作用，安全性高于尿素，可部分替代豆餅粕等蛋白質(zhì)飼料，擴大飼料來源，降低飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟效益，同時彌補我國蛋白質(zhì)飼料資源不足［5］的困境。這種添加劑最初由德國巴斯夫(BASF)化學(xué)公司開發(fā)利用，20世紀(jì)70年代開始廣泛應(yīng)用于發(fā)達的歐、美地區(qū)國家以及日本等的牛羊飼養(yǎng)業(yè)，它是歐共體(EC)飼料業(yè)法定Ⅰ類添加劑，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦使用的反芻動物專用營養(yǎng)添加劑和磷的補充劑。我國于20世紀(jì)80年代后期開始對磷酸脲進行研究和開發(fā)利用，易建明等［6］的研究表明每頭奶牛每天喂磷酸脲150 g，喂60 d，產(chǎn)奶量可提高2.8%，乳脂率提高 5.6%。

關(guān)于尿素對肉羊的安全性，已有研究從尿素對肉羊的生長性能、屠宰性能、肉品質(zhì)方面［7］及血液學(xué)、血清學(xué)、組織病理學(xué)方面［8］進行探討，結(jié)果表明在1.5%的尿素添加量下不會產(chǎn)生顯著影響，但在2.5%的添加量下會使肉羊發(fā)生中毒癥狀。

血液和肌肉中鈣(Ca)、磷(P)的含量是反映動物健康狀況的重要指標(biāo)。鈣、磷的缺乏會影響動物的骨骼形成、生長速度、食欲、繁殖性能等。磷酸脲中含有家畜所需的重要元素磷，血液的鈣、磷平衡對家畜的生理健康有著重要的作用。因此在利用磷酸脲作為羔羊非蛋白氮源時，通過血液和肌肉中鈣、磷的含量及相關(guān)激素含量來評價磷酸脲對羔羊的安全性有重要意義。本試驗選用的羔羊初始體重為(25.86±4.07)kg，在試驗結(jié)束時各組(除最高添加量組)平均體重為42～43 kg，此時期是羔羊育肥的最佳階段，選用磷酸脲作為非蛋白氮來源代替植物蛋白質(zhì)具有重要利用價值和經(jīng)濟效益。

關(guān)于磷酸脲對反芻動物生產(chǎn)性能和替代蛋白質(zhì)飼料的作用已經(jīng)有相應(yīng)的研究，但磷酸脲對肉羊的血清和肌肉中鈣、磷含量的影響還鮮有報道，本試驗旨在研究不同磷酸脲添加量對血清和肌肉鈣、磷含量及血清相關(guān)激素含量的影響，同時對磷酸脲在肉羊飼養(yǎng)中作為飼料添加劑進行安全性評價。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗與2014年4月8日至2014年6月30日于北京市大興區(qū)佟營羊場進行，歷時72 d，其中預(yù)試期12 d，正試期60 d。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

本試驗采用單因子隨機分組設(shè)計，選用80只3 月齡、平均體重為(25.86±4.07)kg 的健康 F1 代杜寒雜交公羔羊，按體重一致的原則隨機分為5組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)2只羊。對照組飼喂不添加磷酸脲的精料，試驗組分別在精料中添加1.0%、2.0%、4.0%、8.0%的磷酸脲以替代部分豆粕等蛋白質(zhì)飼料。每日飼喂2次(08:00、20:00)，先喂粗料，后喂精料。預(yù)試期內(nèi)飼喂精料和粗料比保持1∶1，自由采食。正試期內(nèi)肉羊精料和粗料采食量比保持1∶1，各組實際采食飼糧中的磷酸脲含量分 別為 0(對照 組)、0.5%(0.5% 組)、1.0%(1.0%組)、2.0%(2.0%組)和 4.0%(4.0%組)，每天的加料量根據(jù)前1天的采食量進行調(diào)整。整個試驗過程肉羊采用全舍飼方式飼養(yǎng)，自由飲水，試驗光照、溫度、免疫按常規(guī)程序進行。

1.3 試驗飼糧

試驗肉羊基礎(chǔ)飼糧的精料參考NRC(2007)［9］及試驗需求配制，由北京市中農(nóng)興飼料科技有限公司制作，粗料為大豆秸，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 試驗材料

本試驗所用磷酸脲為無色透明棱柱狀晶體，由中化云龍有限公司提供，含非蛋白氮(尿素態(tài)氮)16%、磷17%。

1.5 樣品的采集及相關(guān)指標(biāo)的檢測

1.5.1 血清鈣、磷及相關(guān)激素含量的測定

分別于1(預(yù)試期開始當(dāng)天)、13(正試期開始當(dāng)天)、73 d(正試期結(jié)束后第1天)每組隨機選取8只羔羊在晨飼前用真空管于頸靜脈穿刺采血約10 mL，離心(1 100×g，10 min)分離血清，血清收集于2 mL的離心管中，－20℃保存，待測。測定的指標(biāo)為 1、13、73 d的鈣、磷含量及 1、13 d的甲狀旁腺素(PTH)、降鈣素(CT)、25羥基維生素D(25-OH-VD)含量。試劑盒購于中生北控股份有限公司，鈣含量測定采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法，磷含量采用紫外終點法按照試劑盒操作說明在日立7160全自動生化分析儀上上測定。PTH、CT、25-OH-VD含量采用放射免疫法測定。血清中的各項指標(biāo)均由北京華英生物技術(shù)研究所測定。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.5.2 肌肉鈣、磷含量的測定

73 d時每組選取6只羔羊進行屠宰，選取背腰最長肌于－20℃中冷凍保存，待測。將冷凍的肌肉于冷凍干燥機中干燥后，經(jīng)回潮，使用干灰化法進行前處理，采用火焰原子吸收儀(perkin Elmer AAS800)測定鈣的含量，用釩鉬酸銨比色法在紫外分光光度計(752型)中測定總磷的含量［11］，波長采用420 nm。

1.5.3 飼糧營養(yǎng)水平的測定

對精料和粗料中的干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、鈣、磷的含量進行測定，測定方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》［12］進行。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)整理采用Excel 2007進行，采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件將試驗所得的數(shù)據(jù)進行平衡試驗設(shè)計的方差分析(ANOVA)，平均值的多重比較采用Duncan氏法進行，顯著水平為 P＜0.05，各組結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 血清鈣、磷含量

由表2可以看出，1 d時，各組血清中鈣、磷含量差異不顯著(P＞0.05)。13 d 時，4.0%組羊的血清中鈣含量顯著低于其他各組(P＜0.05);在血清磷含量中，1.0%組羊與其他各組間差異不顯著(P＞0.05)，4.0%組顯著高于除 1.0%組的其他各組(P＜0.05)，對照組、0.5%組、2.0%組間差異不顯著(P＞0.05)。73 d時磷酸脲的添加量對血清中鈣含量影響不顯著(P＞0.05);血清磷含量中4.0%組顯著高于對照組、0.5%組(P＜0.05)，對照組顯著低于1.0%組、2.0%組、4.0%組(P＜0.05)，0.5%組、1.0%組、2.0%組間差異不顯著(P＞0.05)。13 和 73 d，隨著磷酸脲添加量的增加血清中鈣的含量有降低的趨勢，磷的含量有增加的趨勢。在同一組中，隨時間延長，各組血清鈣含量有降低的趨勢，血清磷含量除對照組外其他各組有增加的趨勢。

表2 不同磷酸脲添加量對羔羊血清鈣、磷含量的影響Table 2 Effects of different levels of dietary urea phosphate on serum calcium and phosphorus contents of lambs mmol/L

2.2 肌肉鈣、磷含量

由表3可以看出，不同的磷酸脲添加量對肌肉中鈣、磷含量的影響均不顯著(P＞0.05)，但隨著磷酸脲添加量的增加，肌肉中鈣含量有降低趨勢，磷含量有增加的趨勢。

表3 不同磷酸脲添加量對羔羊肌肉鈣、磷含量的影響(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 3 Effects of different levels of dietary urea phosphate on muscle calcium and phosphorus contents of lambs(air-dry basis) %

2.3 血清相關(guān)激素含量

由表4可以看出，磷酸脲的添加量對血清PTH和25-OH-VD含量影響差異不顯著(P＞0.05)。13 d 時，1.0%組和2.0%組的 CT 含量顯著低于對照組和 4.0%組(P＜0.05)，0.5%組、1.0%組、2.0%組間差異不顯著(P＞0.05)，對照組、0.5%組、4.0%組間差異不顯著(P＞0.05)，13 d 時除4.0%組外的其他各組的血清中CT含量隨磷酸脲添加量增加有降低趨勢，而4.0%組出現(xiàn)突然的增加。13 d時的4.0%組血清25-OH-VD含量遠低于同期其他各組。在同組間13 d的血清PTH、CT、25-OH-VD含量都高于1 d。

表4 不同磷酸脲添加量對羔羊血清甲狀旁腺素、降鈣素和25－羥基維生素D含量的影響Table 4 Effects of different levels of dietary urea phosphate on serum PTH，CT and 25-OH-VD contents of lambs

3 討 論

3.1 磷酸脲對羔羊血清鈣、磷含量的影響

張力等［13］報道，奶牛血清磷含量在 1.06～3.39 mmol/L之 間，血 清 鈣 含 量 在 2.43 ～3.05 mmol/L之間。Peterson 等［14］報道奶牛血清磷含量平均值在 2.09～2.17 mmol/L，血清鈣含量在 2.35～2.47 mmol之間。Kaneko［15］研究綿羊的血清鈣含量的正常值為 2.5～3.0 mmol/L，而王小龍［16］和王俊東等［17］的綿羊血清鈣含量參考值均為 2.88～3.20 mmol/L，本試驗的羔羊血清鈣含量均低于該參考值的下限，或者僅有少數(shù)在Kaneko［15］報道正常值的下限。在對照組中血清的鈣含量也較低，因此這可能與此次試驗的環(huán)境條件及羔羊的生長狀況有關(guān)。本次試驗的肉羊處于3～5月齡，正是羔羊的快速生長階段，機體的快速生長特別是骨骼的生長容易導(dǎo)致血清鈣含量的降低，這可能也是各組73 d的羔羊血清鈣含量低于1和13 d的原因。試驗組的血清中鈣含量的降低除與羔羊的機體生長有關(guān)，可能也與磷酸脲的添加有關(guān)。在正試期中，各組血清鈣含量隨著磷酸脲的添加量增加呈明顯的下降趨勢，這可能與磷酸脲溶液的酸性有關(guān)。磷酸脲溶液有較強酸性，1.0%的磷酸脲溶液pH為1.89，因此作為反芻動物添加劑，我們必須考慮它可能引發(fā)的瘤胃酸中毒，趙晨旭等［18］的研究表明，當(dāng)肉牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒時，血液中鈣的含量降低，因此隨著磷酸脲添加量的增加，瘤胃液的pH降低，從而導(dǎo)致細胞外液的氫離子(H+)濃度增加而進入細胞內(nèi)，使得鉀離子(K+)逸出細胞外以維持細胞外的pH的恒定。K+的外流使得細胞超極化，導(dǎo)致鈣離子(Ca2+)的通道關(guān)閉，Ca2+無法轉(zhuǎn)移到細胞外，特別使得血液中Ca2+濃度降低。本試驗過程中沒有出現(xiàn)羊的嚴(yán)重瘤胃酸中毒導(dǎo)致的死亡，這可能是在預(yù)試期的適應(yīng)使得肉羊的自身調(diào)劑能力增強，但磷酸脲較強的酸性還是會導(dǎo)致瘤胃液pH降低，進而使血清鈣含量隨磷酸脲添加量增加而降低。13 d時4.0%組羔羊血清中的鈣含量顯著低于對照組，而在73 d時盡管血清鈣含量仍低于對照組，但差異不顯著，說明羔羊?qū)C體內(nèi)的鈣、磷含量有一定的調(diào)節(jié)能力，以維持其平衡。

據(jù)王俊東等［17］的報道，綿羊血清無機磷含量的正常參考值在 1.61～2.35 mmol/L之間。本試驗中各組羊的血清磷含量均在該參考值范圍內(nèi)，說明磷酸脲在這幾個添加量下是安全的。蘇月娟等［19］研究發(fā)現(xiàn)，豬血清中鈣、磷含量與飼糧中磷含量的高低呈強相關(guān)性，且隨飼糧磷水平的升高表現(xiàn)出先升高后降低的二次曲線變化趨勢;陳娟［20］研究發(fā)現(xiàn)隨飼糧中磷含量的增加，肉雞血清中鈣的含量顯著降低，血清中磷的含量顯著增加。在本試驗中血清中磷的含量隨磷酸脲添加量的增加而增加，這可能與試驗飼糧中因磷酸脲的添加量增加引起的飼糧中磷含量的增加有關(guān)。血清中鈣含量的降低與飼糧中磷水平的增加也有一定的關(guān)系。

3.2 磷酸脲對羔羊肌肉鈣、磷含量的影響

肌肉是肉羊的重要產(chǎn)品，肌肉中的鈣、磷含量變化是肉羊肉用性能的重要參數(shù)，本試驗中，肌肉中的鈣、磷含量差異不顯著，鈣的含量隨磷酸脲的添加量增加而有降低的趨勢，磷的含量也稍有增加的趨勢，但各組間的鈣、磷含量基本處于恒定。肌肉中鈣、磷含量的變化趨勢與血清相似，楊鳳［21］的研究表明礦物質(zhì)在動物體內(nèi)的分布處于一個動態(tài)的平衡中，因此血清中相關(guān)礦物質(zhì)含量的增加或減少會引起肌肉中對應(yīng)礦物質(zhì)含量的變化。紀(jì)守坤［22］的研究表明肉羊的飼喂水平對其肌肉中的鈣、磷含量沒有顯著的影響，其經(jīng)試驗測得的同期杜寒雜交羔羊每100 g肌肉(鮮重)含鈣11.89 mg，磷 181.13 mg，對應(yīng)的干樣中含鈣 0.040 3%，磷0.614%。此結(jié)果略小于本試驗結(jié)果，原因可能為本試驗選取肌肉位置為羊背腰最長肌部位，而紀(jì)守坤［22］的羊肉采集部位為全身羊肉的混合樣。此次試驗的肉羊肌肉鈣、磷含量與對照組相比差異不顯著，說明磷酸脲在此飼喂條件下對肌肉鈣、磷的含量作用不明顯，各個試驗組與對照組相比處于恒定狀態(tài)，說明動物具有一定的自我調(diào)控能力，維持肌肉中礦質(zhì)元素保持恒定。

3.3 磷酸脲對羔羊血清相關(guān)激素含量的影響

反芻動物的鈣、磷代謝調(diào)控主要由PTH、CT和25-OH-VD 3種激素共同調(diào)節(jié)，這3種激素對血清中鈣、磷的平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用。PTH是由甲狀旁腺主細胞分泌的堿性單鏈多肽類激素，分子質(zhì)量9 ku。它的主要功能是調(diào)節(jié)脊椎動物體內(nèi)鈣和磷的代謝，促使血清鈣含量升高，血清磷含量下降。CT的分泌與流經(jīng)甲狀腺的血液中鈣含量有關(guān)，它可以降低血清鈣含量。25-OH-VD對體內(nèi)骨骼組織的礦質(zhì)化過程有著非常重要的作用，它可以提高動物對鈣、磷的吸收，使血清鈣和磷的含量達到飽和程度，促進生長和骨骼鈣化，促進牙齒健全;通過腸壁增加磷的吸收，并通過腎小管增加磷的再吸收，25-OH-VD是重要的維生素代謝產(chǎn)物，臨床應(yīng)用于骨代謝指標(biāo)聯(lián)合檢測骨質(zhì)疏松和佝僂病，用以診斷鈣的缺乏。因此研究血清中PTH、CT、25-OH-VD含量的變化是研究磷酸脲對血清和肌肉中鈣、磷含量變化的重要基礎(chǔ)。

血清鈣的平衡是一個復(fù)雜的攝入、排出和再循環(huán)的過程［23］。本試驗中，各組間因磷酸脲添加量的增加，使得飼糧中磷攝取量增加，促使血清鈣含量降低，血清磷含量增加。血清鈣和磷含量的變化又會反饋調(diào)節(jié)機體內(nèi)的PTH、CT、25-OH-VD的含量。當(dāng)血清鈣含量降低時，會刺激甲狀旁腺合成和分泌PTH［24］，增強腎小球?qū)︹}的重吸收;同時刺激肝和腎中1，25－二羥維生素D3合成，使得骨鈣被活化，提高體內(nèi)血清鈣的含量。在本試驗過程中13 d時的各組血清鈣含量低于1 d，但PTH和25-OH-VD的含量在13 d時明顯高于1 d。CT是體內(nèi)降低血清鈣含量的主要激素，它的含量與血清鈣含量呈正相關(guān)。在本試驗中，除4.0%組外其他各組的血清CT含量隨磷酸脲添加量增加而降低，與血清鈣含量變化趨勢相同。Kichura等［25］用含10和82 g磷的飼糧飼喂奶牛，高磷飼糧組血漿25-OH-VD和血清鈣含量低于低磷組，高磷組的血清磷含量高于低磷組，高于6.0 mg/dL，該結(jié)果與本試驗結(jié)果相一致。飼糧中磷含量的增加引起血清中鈣含量的降低，磷含量的增加，進而反饋調(diào)節(jié)血清中PTH、CT、25-OH-VD的含量。13 d時4.0%組血清CT含量沒有隨磷酸脲量的增加而繼續(xù)降低，而是突然地增加，其含量與對照組差異不顯著，原因可能是盡管該組的飼糧中加入高水平磷酸脲，但該組羊處于中毒狀態(tài)，其采食量低于其他各組，從而采食的磷酸脲也降低，影響了血清中 CT的含量。4.0%組的25-OH-VD含量平均值為35.31 ng/mL，而同期的其他各組的含量在 46.01～47.00 ng/mL 之間，相應(yīng)的血清鈣含量也低于對照組，其原因可能為4.0%組的高的含磷量及磷酸脲的強酸性，體內(nèi)的鈣和25-OH-VD含量的降低，血清磷含量的顯著增加。

在本試驗過程中試驗開始時(1 d)對照組、0.5%組、1.0%組、2.0%組和 4.0%組的平均體重依次是 26.01、25.84、25.94、25.93 和 25.56 kg，而試驗結(jié)束時(73 d)各組的平均體重依次是42.34、42.57、43.59、42.45 和 28.38 kg。由此可以看出，僅4.0%組很少增重，其他各組在試驗結(jié)束時體重相近，推測4.0%組處于中毒狀態(tài)而影響到了生長性能。但4.0%組的血清和肌肉中鈣、磷及相關(guān)激素含量中，僅血清磷含量顯著高于對照組。而血清磷含量的增加主要緣于飼糧中的磷水平提高，由此可見通過血清磷和肌肉中鈣、磷含量及血清相關(guān)激素含量并不能很好反映羔羊的中毒情況，因此也不能作為磷酸脲對羔羊安全性的最佳評價指標(biāo)。

4 結(jié)論

磷酸脲添加量的增加會引起飼糧磷含量增加，使飼糧鈣、磷比發(fā)生變化，引起羔羊血清中鈣含量的降低，磷含量的增加，肌肉中的鈣、磷的含量基本處于恒定狀態(tài)。血清中磷含量增加會反饋調(diào)節(jié)血清中相關(guān)激素含量，對血清中PTH和25-OH-VD沒顯著影響，但會引起CT含量的顯著變化。

飼糧中添加4.0%的磷酸脲會抑制羔羊的增重。

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