巨曉軍 楊海明 王志躍 馬尹鵬 謝艷娟 蔡中梅

(揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009)

1893年，Klemperer研究發(fā)現(xiàn)雞可以通過卵向雛雞轉(zhuǎn)移抗體。此后，通過各種抗原(細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì))在產(chǎn)蛋雞中產(chǎn)生的特異性抗體向卵黃中轉(zhuǎn)移并蓄積的情況進(jìn)行了大量研究，雞被動免疫首次引起了人們的注意。Wiliiams等［1］發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗原免疫后的產(chǎn)蛋母雞血清中可產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，同時將血清免疫球蛋白有效地轉(zhuǎn)移到卵黃中。卵黃蓄積作用使卵黃中的卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)含量顯著高于血清中IgY含量。Sehade等［2］在1995年首先使用“IgY技術(shù)”這一術(shù)語。IgY抗體的生產(chǎn)和應(yīng)用被定義為IgY技術(shù)。

Zhang等［3］研究結(jié)果表明，種雞免疫1周后可以在蛋中檢測到免疫球蛋白，隨時間的延長，雞蛋中IgY含量逐漸增加，第5周達(dá)到最高水平，且此水平可維持4周，然后逐漸降低。Ulmer-Franco等［4］研究發(fā)現(xiàn)，隨著產(chǎn)蛋雞日齡的增大，雞蛋中IgY含量逐漸增多，但其在孵化期間卵黃囊中IgY含量反而比同期較小日齡雞所產(chǎn)蛋的IgY含量少，是否存在IgY的不同吸收率卻不得而知。Sun等［5］通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的方法對卵黃與血清中的總IgY含量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)卵黃中總IgY含量與血清中總IgY含量之間存在顯著相關(guān)性;產(chǎn)蛋雞對IgY有濃集作用，卵黃中的抗體濃度高于血漿。隨著對IgY研究的不斷深入，IgY作為免疫強(qiáng)化劑正逐步被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)中。

1 IgY的特性

當(dāng)家禽經(jīng)特定抗原免疫后，可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)，在流經(jīng)卵巢時，特異性抗體在卵細(xì)胞中逐漸蓄積，并儲存在卵黃中，這種存在于卵黃中的抗體稱為IgY，也稱卵黃抗體。在種蛋的孵化過程中，卵黃中IgY逐步被禽胚吸收進(jìn)入禽胚血液中，雛禽出殼后，其血液中的IgY可為其提供強(qiáng)有力的被動免疫，是禽類在長期進(jìn)化過程中形成的用于提高雛禽抵抗力的物質(zhì)［6-7］。

IgY的結(jié)構(gòu)呈“Y”形，由4條鏈組成，即2條重鏈(H鏈)和2條輕鏈(L鏈)，重鏈由1個可變區(qū)(V)和 4 個恒定區(qū)(Cυ1、Cυ2、Cυ3、Cυ4)組成，沒有鉸鏈結(jié)構(gòu)。其完整分子質(zhì)量為180 ku，重鏈為67～70 ku，輕鏈為25 ku，但還存在1個小體積副本為 120 ku(5.7 S)。5.7 S IgY 與 F(ab)2 片段十分相似，因此正確名稱為IgY(△Fc)，其重鏈為υ(△Fc)。7 S IgY和 5.7 S IgY(△Fc)可共存于同一種動物或單獨存在。免疫球蛋白G(IgG)的重鏈，由 1個可變區(qū)和 3 個恒定區(qū)(Cγ1、Cγ2、Cγ3)組成，Cγ1與Cγ2之間為絞鏈區(qū)，此區(qū)域使Fab片段具有相當(dāng)大的靈活性［8］。比較IgG和IgY的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(圖1)，IgG具有鉸鏈區(qū)，F(xiàn)c片段較短，有2對碳水化合物基團(tuán)。IgY的Fc片段較長，有3對碳水化合物基團(tuán)。IgG的 Cγ2、Cγ3與 IgY的Cυ3、Cυ4極相似，有研究者認(rèn)為 Cυ2 包含 IgG 的鉸鏈區(qū)，是 IgY沒有進(jìn)化完全的結(jié)果［9］。在IgY分子結(jié)構(gòu)上的 Cυ1-Cυ2 和 Cυ2-Cυ3 間存在脯氨酸、甘氨酸殘基，這些區(qū)域為IgY分子提供了一定的擺動性。IgY有更多的疏水性分子，使它更適合脂類含量豐富的卵黃環(huán)境［10］。

圖1 IgG與IgY的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of IgY and IgG

IgY具有較強(qiáng)的耐酸、耐熱、耐高滲(在60%的蔗糖溶液中仍有活性)、抗離子強(qiáng)度和抗特定酶解(如胃蛋白酶)的能力［11］，在 pH 4～11時穩(wěn)定，在pH低于3時，活性大部分喪失，隨著pH降低更為顯著。IgY在4℃條件下儲存5～10年，IgY的活性不會受到明顯的損失;在室溫條件下其抗體活性可保持6個月之久，在37℃條件下則可維持1個月。冷凍干燥處理對lgY活性有不利的影響;-20和4℃環(huán)境中，IgY凍干粉具有良好的貯藏穩(wěn)定性［12］。還有報道證明IgY還具有反復(fù)凍融的特性［13］。

IgY無毒副作用，具有良好的免疫活性，克服了飼料中添加抗生素或某些化學(xué)合成藥物所引起的耐藥性和藥物殘留問題，具有綠色、高效、環(huán)保價值，對于畜禽業(yè)的健康持續(xù)快速發(fā)展具有重要意義［15］。此外，IgY還具有許多獨特的優(yōu)點，例如不需要采集動物的血液，只需要收集禽類的蛋就可以獲得抗體;免疫少量的抗原，就可以獲得大量均一的特異性抗體;禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白不發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng);將IgY作為一種試驗診斷試劑和免疫治療劑，可避免免疫檢測中產(chǎn)生的假陰性或假陽性結(jié)果而提高了免疫學(xué)檢測的準(zhǔn)確性。IgY分離方便，分離技術(shù)成熟，分離效果較好，從而使得IgY被廣泛運用于人類保健、疾病診斷和疾病防治［16］，成功運用于葡萄球菌腸毒素的檢測［17］，在治療新生兒腸道輪狀病毒、細(xì)菌性痢疾所引起的腹瀉方面成效顯著［18］，是可用于預(yù)防毒蛇毒液的有效保護(hù)品［19］，甚至成為治療某些疾病的特效藥［20］。IgY的這些優(yōu)點，激發(fā)了大家對IgY提取方法的研究，使其提取純度和質(zhì)量得到不斷提高，正逐步在畜禽生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

2 抗細(xì)菌IgY的作用機(jī)理

大腸桿菌、沙門氏菌等一些有害菌需要黏附于動物腸道黏膜細(xì)胞才能增殖，在動物體內(nèi)產(chǎn)生毒素并使動物感染。而IgY的抗菌作用機(jī)理主要的作用方式有:特定病原菌IgY直接黏附于病原菌的細(xì)胞壁，破壞病原菌的完整性，抑制其生長。程學(xué)慧等［21］采用空腸上皮細(xì)胞懸浮液，研究抗K88菌毛I(xiàn)gY體外對腸毒性大腸埃希桿菌K88黏附性的影響，結(jié)果表明，抗K88菌毛I(xiàn)gY能有效抑制K88對仔豬空腸上皮細(xì)胞的黏附，這與Yokoyama等［22］的報道是基本一致的，并且其抑制作用隨抗體效價的增強(qiáng)顯著增強(qiáng)。王吉譚等［23］利用鹽析法和冷凍干燥法制備抗豬大腸桿菌卵黃抗體粉，配制不同蛋白含量的卵黃抗體溶液，用體外法研究卵黃抗體對大腸桿菌生長及對腸黏膜細(xì)胞黏附的影響，試驗結(jié)果表明，抗豬大腸桿菌卵黃抗體對大腸桿菌在腸黏膜細(xì)胞上的黏附有抑制作用，大腸桿菌的生長受到抑制。

IgY可直接黏附于病原菌的菌毛或鞭毛上，使其不能黏附于黏膜上皮細(xì)胞而被排出體外，導(dǎo)致腸道中致病性菌體減少或增殖減弱。Rahimi等［24］分別使用含抗沙門氏菌的IgY粉、卵清和少量奶粉等飼喂雛雞，發(fā)現(xiàn)IgY能夠抑制沙門菌黏附在腸黏膜上。王劼［25］用分離提純蛋白免疫獲得的Anti-K88ac噴霧干燥全蛋粉、Anti-rFaeG噴霧干燥全蛋粉和Anti-FaeG-FedF噴霧干燥全蛋粉與利用體外試驗重組蛋白rFaeG和FaeG-FedF免疫獲得的卵黃抗體抑制細(xì)菌黏附作用，結(jié)果顯示，提純蛋白免疫獲得的Anti-K88ac噴霧干燥全蛋粉、Anti-rFaeG噴霧干燥全蛋粉和Anti-FaeG-FedF噴霧干燥全蛋粉3種卵黃抗體粉對細(xì)菌黏附腸上皮細(xì)胞均具有顯著抑制作用，且三者的作用效果無明顯差異;由重組菌毛蛋白rFaeG和Fae-FedF制備的卵黃抗體也可以有效抑制K88ac對仔豬腸上皮細(xì)胞的黏附;此外，具備2種菌毛基因型的融合蛋白FaeG-FedF免疫獲得的卵黃抗體，不僅可以抑制同源菌株F18ac的黏附作用，還可以阻斷異源菌株F18ab對腸上皮細(xì)胞的黏附。

此外，部分IgY在消化酶的作用下降解為可結(jié)合片段，含有抗體的片段可變成容易被腸黏膜吸收的小肽(Fab)，進(jìn)入血液，與特定的病原菌黏附因子結(jié)合后使其不能黏附于易感細(xì)胞而失去致病性，而IgY的穩(wěn)定部分則仍留在腸內(nèi)。Fab片段還能夠與宿主血液中的球蛋白末端結(jié)合，使其免遭機(jī)體的破壞［26］。Yokoyama 等［27］分別給不同日齡的仔豬飼喂100 mg/mL的IgY(抗-K88菌毛抗體，滴度4 800)，分別測定胃腸道和血液中卵黃抗體分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體不被未成熟的胃腸道環(huán)境破壞，能穩(wěn)定地通過胃，并能通過胃腸道的吸收轉(zhuǎn)運至循環(huán)系統(tǒng)。給奶牛飼喂無乳鏈球菌和葡萄球菌免疫了的雞蛋飼糧，結(jié)果表明含抗無乳鏈球菌和葡萄球菌的IgY經(jīng)口服后，可通過血液循環(huán)在非腸道部位發(fā)揮作用。

3 IgY在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用

3.1 在家禽生產(chǎn)上的應(yīng)用

3.1.1 促進(jìn)生長發(fā)育

楊海明等［28］對海蘭公雛雞生長性能及免疫器官和腸道生長發(fā)育的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明開食飼糧中添加IgY提高了雛雞體重，促進(jìn)了法氏囊、脾臟、十二指腸、空腸和回腸的生長發(fā)育。陸建等［29］對海蘭公雛雞早期生長性能、內(nèi)臟器官生長發(fā)育、卵黃囊吸收、血清蛋白含量的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明飼糧中添加IgY可促進(jìn)雛雞生長發(fā)育，一定程度上維持內(nèi)臟器官正常生長發(fā)育，提高免疫機(jī)能。

朱錦蘭等［30-33］對肉鴨的生長性能、相關(guān)生理生化指標(biāo)及代謝激素水平等方面開展了研究，研究結(jié)果表明:1)添加IgY使肉鴨平均日增重提高，料重比降低，但小鴨階段要比大鴨階段效果好;2)添加IgY使肉鴨小腸不同部位的pH降低，各小腸段內(nèi)容物的胰蛋白酶活性都有所提高，其中空腸的胰蛋白酶活性達(dá)到顯著水平;3)試驗組血清三碘甲狀腺原氨酸(T3)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)水平有顯著的提高，甲狀腺素(T4)水平有升高趨勢但不顯著。以上結(jié)果表明了卵黃抗體添加劑能提高小腸胰蛋白酶活性和影響有關(guān)代謝激素水平，從而促進(jìn)肉鴨生長。

3.1.2 疾病預(yù)防和治療

IgY與抗原相結(jié)合，能有效地消除入侵機(jī)體的病原體，中和病原體所產(chǎn)生的毒素，是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。在家禽疾病預(yù)防和治療中，IgY發(fā)揮了較好的作用。在開食料中添加IgY，能較好地阻止和消除腸道沙門氏菌及大腸桿菌［34］;可以減少卵黃囊營養(yǎng)物質(zhì)的浪費，提高雛雞對球蟲病的抵抗力，降低球蟲對雛雞盲腸的危害［35］。武桂梅等［36］在雞飼糧中添加抗雞白痢沙門氏菌病IgY干燥粉，研究發(fā)現(xiàn)總發(fā)病率降低，增重率提高。Mahdavi等［37］將抗大腸桿菌 O78∶K80 卵黃抗體添加到飼糧中飼喂給感染大腸桿菌O78∶K80的雛雞，研究結(jié)果表明，IgY能夠改變腸道健康指數(shù)和雛雞對O78∶K80的免疫應(yīng)答。此外，IgY在治療畜禽疾病如新城疫、法氏囊、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟病等方面均有較大的應(yīng)用潛力［38］。張桂枝等［39］在肉雞場推廣應(yīng)用抗雞新城疫和傳染性法氏囊病二聯(lián)IgY預(yù)防雞新城疫和染性法氏囊病，保護(hù)率達(dá)100%，早期治愈率為63%～85%。張倫［40］對抗雞傳染性法氏囊病毒卵黃抗體動物進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗，結(jié)果表明，雞傳染性法氏囊病毒-IgY抗體可有效保護(hù)攻毒雞只，并且對同居感染雞有很好的預(yù)防效果。Fu等［41］成功應(yīng)用β-丙內(nèi)脂滅活的非典型肺炎(SARS)病毒免疫雞無特定病原(SPF)母雞制得的抗SARS的IgY可有效抑制SARS病毒的增殖。Rahimi等［42］將使用滅活的H9N2禽流感病毒制得的IgY給雛雞飲用，利用人工感染病毒進(jìn)行攻毒試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雛雞糞便中病毒含量極顯著降低。劉大鵬［43］研究表明，鴨源抗鵝細(xì)小病毒IgY對鵝細(xì)小病毒感染有極顯著的預(yù)防和治療效果。

3.2 在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用

IgY對仔豬的生長性能、疾病的控制和預(yù)防及肉品質(zhì)方面具有廣泛的應(yīng)用效果。羅淡彬［44］通過在14日齡仔豬的基礎(chǔ)飼糧添加IgY，結(jié)果表明IgY能顯著提高仔豬早期斷奶的生長性能，提高隔離早期斷奶仔豬的免疫力，改善仔豬早期斷奶后腸道微生物環(huán)境和降低仔豬腹瀉。彭健等［45］用28日齡斷奶仔豬進(jìn)行飼養(yǎng)試驗，結(jié)果表明添加1%噴霧干燥卵黃粉顯著降低了仔豬的料重比和腹瀉率，提高了日增重，說明IgY對控制仔豬腹瀉以及促進(jìn)斷奶仔豬增重和飼料轉(zhuǎn)化率方面具有良好的作用。余冰等［46］在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加含膽囊收縮素抗體卵黃粉，仔豬全期平均日增重和平均日采食量提高，料重比降低。同時，飼糧粗蛋白質(zhì)消化率隨含膽囊收縮素抗體卵黃粉添加量的增加呈二次曲線變化。姜錦鵬［47］在豬的飼糧中添加脂肪組織細(xì)胞膜蛋白IgY，在降低脂肪沉積和促進(jìn)蛋白質(zhì)沉積的同時，不影響豬背最長肌中脂類的含量、大理石紋和pH，并且還顯著改善了肉色及豬的胴體品質(zhì)。索江華等［48］制備豬圓環(huán)病毒2型高免卵黃抗體，并對其治療效果進(jìn)行研究，觀察其治療效果，結(jié)果顯示抗體效價達(dá)到1∶64;人工感染治療試驗治愈率達(dá)100%;臨床試驗治愈率為96%，應(yīng)用效果良好。

3.3 在反芻動物生產(chǎn)上的應(yīng)用

初生犢牛和仔豬可通過腸道吸收初乳獲得被動性免疫，預(yù)防腹瀉。若吸收初乳同時口服特異性IgY，這種免疫保護(hù)作用將顯著增強(qiáng)。試驗證明，喝接種過免疫球蛋白的牛初乳可以防止由最常見的腸道致病菌大腸桿菌引起的腹瀉。給患小牛致死性傷寒沙門氏菌的犢?？诜呙釯gY粉，隨著卵黃抗體滴度的升高，犢牛出現(xiàn)腹瀉和高熱的時間延遲，提示該IgY雖不能100%治愈該病，卻可以大大降低死亡率。

4 小結(jié)

面對畜禽生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題，人們采取了很多應(yīng)對措施，其中不乏采用免疫接種和添加抗生素，也就是說，幼齡動物自出生起就一直被動地接受疫苗和各類抗生素。事實上，為了有效地控制禽類疾病，減少甚至避免養(yǎng)殖過程中藥物的使用，最有效的方法應(yīng)是提高家禽的自身抵抗力。雞IgY具有性能穩(wěn)定、成本低廉、產(chǎn)量高、應(yīng)用效果好等優(yōu)點，近年來，IgY作為潛在的飼料添加劑迅速發(fā)展，目前已經(jīng)有相關(guān)產(chǎn)品問世。商業(yè)化養(yǎng)禽場中，家禽面臨著許多傳染性因子的威脅，如果IgY能夠?qū)钩Ｒ娭虏∥⑸锏那忠u，則在家禽生產(chǎn)上貢獻(xiàn)會很大。但現(xiàn)在IgY主要研究集中在對種雞進(jìn)行特異性免疫獲得的特異性抗體，事實上，雞蛋中所含的抗體更多的是非特異性抗體，若能充分發(fā)揮非特異性卵黃抗體的作用必將達(dá)到意想不到的效果。

IgY作為添加劑進(jìn)行大規(guī)模的應(yīng)用還存在一定的問題，母雞對一個抗原的免疫應(yīng)答會因每次應(yīng)激不同而變化很大。卵黃中IgY水平的可變性是個值得考慮的因素，管理方面的低效和環(huán)境方面的應(yīng)激都會加劇抗體水平的易變性。因此，還需加強(qiáng)IgY的深入研究，使得IgY作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。

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