李樹戰(zhàn)，王圣潔，劉君昂，吳 毅，何苑皞，李 河

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

不同杉木人工林土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究

李樹戰(zhàn)，王圣潔，劉君昂，吳 毅，何苑皞，李 河

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

為了探討土壤線蟲在人工林生態(tài)系統(tǒng)中的功能及其對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)。該研究利用18S rDNA的宏基因組比較了湖南省攸縣不同發(fā)育階段（3年、13年、26年）以及不同栽培代數(shù)（1代、2代、3代）杉木人工林的土壤線蟲的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。結(jié)果表明：(1)測序共獲得了2 111條隸屬于線蟲動(dòng)物門的序列。經(jīng)聚類后產(chǎn)生了27個(gè) OTUs。主要類群有Prismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、Criconematidae、Plectidae 它們分別占總序列數(shù)的31%、15%、11%、8%、6%、5%，其中 Prismatolaimidae 在所有樣地中均占絕對(duì)優(yōu)勢，Aphelenchidae、Cephalobidae、Criconematidae、Rhabdolaimidae、Tylenchidae這5個(gè)類群的相對(duì)豐度在各樣地間具有顯著性差異（p＜0.05）；(2) 冗余分析（RDA）發(fā)現(xiàn)所選的5塊樣地的線蟲的群落結(jié)構(gòu)有著明顯的差異，F(xiàn)RC，SYC，TYC三塊樣地的群落結(jié)構(gòu)較為相似。FYC與FRC之間差異性最大；(3) 6種不同的多樣性指數(shù)的單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，各樣地的多樣性指數(shù)之間沒有達(dá)到顯著性差異。說明長期種植單一杉木人工林能夠改變土壤線蟲的群落組成，但并沒有改變種群的多樣性。土壤線蟲中存在種的冗余現(xiàn)象。

杉木人工林；線蟲；宏基因組分析；群落結(jié)構(gòu)；群落多樣性

杉木Cunninghamia lanceolata是我國特有的速生用材樹種之一。由于結(jié)構(gòu)均勻，紋理通直，不翹不裂，生長快，分布廣，單產(chǎn)高，運(yùn)銷范圍廣，銷售數(shù)量大，古往今來，杉木一直是我國重要的栽培樹種，在我國森林蓄積量與木材生產(chǎn)中占有重要的地位[1]。但因杉木人工林的純林化以及多代連栽現(xiàn)象的加劇導(dǎo)致地力的衰退，同時(shí)還出現(xiàn)了生產(chǎn)力下降、水土流失增加、病蟲害增加等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營[2]。

土壤作為森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分和物質(zhì)基礎(chǔ)，在維護(hù)森林健康、促進(jìn)森林更新中發(fā)揮著重要的作用[3]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中,地上部分的生物與地下部分的生物在群落和生態(tài)系統(tǒng)水平上是相互作用的，并深刻影響著陸地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。2004年，國際著名刊物Science發(fā)表了系列文章：Soils： The Final Frontier，以喚起各國政府及科學(xué)界對(duì)土壤生態(tài)學(xué)研究的重視[4]。

線蟲（Nematode）是一類生活在土壤或腐爛的植被中的無脊椎動(dòng)物，以有機(jī)質(zhì)、微生物(如細(xì)菌)為食，在各類土壤中均非常豐富。它們?cè)谕寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)腐屑食物網(wǎng)中占有重要的地位，是有機(jī)質(zhì)的分解、植物營養(yǎng)的礦化及養(yǎng)分循環(huán)的基礎(chǔ)，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的功能[5]。由于線蟲具有分布廣泛，生存和適應(yīng)能力強(qiáng)，直接參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，占據(jù)土壤食物網(wǎng)的很多關(guān)鍵鏈接，對(duì)環(huán)境變化敏感，實(shí)驗(yàn)周期短等諸多優(yōu)點(diǎn)[6-7]。美國學(xué)者Neher[8]指出線蟲群落(Nematode community)可以作為土壤健康的指示生物。 自80 年代起，線蟲開始被用于陸生群落環(huán)境變化的指示生物。90年代，線蟲對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境指示作用引起越來越多的重視[9]。目前已成為生態(tài)學(xué)上指示生物的首選對(duì)象之一。

目前，土壤線蟲研究多采用線蟲形態(tài)鑒定法，而且形態(tài)鑒定法工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、難以快速分析多個(gè)土壤樣品的線蟲群落特征，這使得土壤線蟲研究在物種深度和樣品廣度方面存在缺陷[10]，限制了土壤線蟲研究的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子生態(tài)技術(shù)被應(yīng)用到土壤線蟲研究中，為線蟲分類鑒定和系統(tǒng)關(guān)系的分析提供了一個(gè)有效的工具。通過線蟲基因序列的比對(duì)分析，可對(duì)線蟲進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究，極大地提高了土壤線蟲研究的精度和效率[11]。

該研究就是借助于第二代測序技術(shù)，以湖南黃豐橋不同發(fā)育階段以及不同栽培代數(shù)的杉木人工林土壤宏基因組為研究對(duì)象。通過對(duì)宏基因組的比較分析，研究了不同杉木人工林土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)與多樣性的變化，對(duì)探明杉木人工林土壤生態(tài)系統(tǒng)過程機(jī)制和提高土壤健康質(zhì)量將具有十分重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)地處羅霄山脈中段武功山西南，呈帶狀橫跨于湖南省攸縣東西部的國有黃豐橋林場，介于東經(jīng) 113°04′～113°43′，北緯 26°43′～27°06′之間。以中低山地貌為主，最高海拔1 270 m，最低海拔115 m。年平均氣溫17.8℃，無霜期292 d，年均降雨量1 411 mm，年蒸發(fā)量1 261～1 388 mm，相對(duì)濕度70%～74%。亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，土壤以板頁巖發(fā)育而成的山地黃壤為主，紅壤、紫色土與山地黃棕壤等也有分布。地帶性植被為常綠闊葉林[12]。

1.2 樣地設(shè)置

該研究在對(duì)國有黃豐橋林場全面調(diào)查的基礎(chǔ)上，選擇了5塊不同發(fā)育階段及不同栽培代數(shù)的杉木人工林作為研究樣地（見表1）。并在每塊樣地中設(shè)置3塊標(biāo)準(zhǔn)地，標(biāo)準(zhǔn)地大小為20 m × 30 m。

1.3 土壤樣品的采集及處理

土壤樣品于2013年4月采集。在每塊標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)分別設(shè)置5個(gè)樣點(diǎn)，采集除去表層土后0～10 cm土層的土壤，每份土樣過篩(＞4 mm)去除根及石塊后，混合均勻放入封口袋。保存于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，存儲(chǔ)于-80℃冰箱中待用。

1.4 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH值測定采用直接測定法；含水量用烘干土法（105℃，8 h）；有機(jī)質(zhì)采用水合熱重鉻酸鉀—硫酸—比色法；全氮采用凱氏定氮法；速效氮采用堿解擴(kuò)散法；速效磷采用鹽酸-氟化銨法；速效鉀采用火焰光度法[13]。

1.5 土壤宏基因組的提取及高通量測序

按照OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒的說明書，對(duì)土壤樣品的總DNA進(jìn)行抽提。抽提后的總DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格后。 以 3NDF(5-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3’)為正向引物，V4_euk_R2(5’- ACGGTATCT(AG)ATC(AG)TCTTCG-3’)為反向引物[14]。對(duì) 15個(gè)土樣總DNA中的18S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCL洗脫；用QuantiFluor? -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)定量，之后進(jìn)行乳液PCR采用的是：Roche GS FLX Titanium emPCR Kits，操作按說明進(jìn)行。將乳液PCR富集的產(chǎn)物使用Sequencing Method Manual-XLR70 kit 進(jìn)行測序前處理。再后采用Roche GS FLX測序系統(tǒng)進(jìn)行高通量測序(由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 測序數(shù)據(jù)的分析

對(duì)序列進(jìn)行歸類操作(cluster)，生成操作分類單元OTUs（Operational Taxonomic Units）該研究采用的是基于序列相似度的方法，以97%相似性為劃分標(biāo)準(zhǔn)，借助UCHIME、Mothur等軟件將序列分為不同的OTUs。提取每個(gè)OTU的代表序列并與SILVA數(shù)據(jù)庫中信息進(jìn)行比對(duì)。獲得測序結(jié)果中的科、屬等信息。

1.6.2 群落結(jié)構(gòu)分析

利用Mothur提取各個(gè)OTU獲得的DNA條數(shù)。并計(jì)算各個(gè)類群的相對(duì)豐度。用R軟件ggplot2軟件包繪制群落結(jié)構(gòu)的Heatmap圖。系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建。各樣地的香濃指數(shù)（Shannon Diversity）、麥金圖史指數(shù)（McIntosh's Index）、辛普森指數(shù)（Simpson's Index）、優(yōu)勢度指數(shù)（Dominance Index）、均勻度指數(shù)（Evenness Index）、伯杰·帕克指數(shù)（Berger-Parker Index）使用BIO-MAP軟件計(jì)算得出。ANOVA分析使用SPSS19軟件。RDA排序分析應(yīng)用CANOCO 4.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)各樣地土壤理化性質(zhì)指標(biāo)差異顯著（見表2）。其中第二代杉木幼林（SYC）的PH值（4.29）、有機(jī)質(zhì)（30.54 g/kg）、全氮（1.62 g/kg）都是最低的。第一代杉木成熟林（FRC）速效氮含量最高，為116.38 mg/kg。第一代杉木中齡林（FMC）速效鉀含量最高，為96.62 mg/kg。第二代杉木幼林（SYC）速效磷含量最高，為1.85 mg/kg。

表2 樣地土壤理化性質(zhì)?Table 2 Physico-chemistry characteristics of the analyzed soil sample

2.2 測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)過454焦磷酸測序，共得了2 111條隸屬于線蟲動(dòng)物門(Nematoda)的序列。采用Mothur 對(duì)得到的的序列進(jìn)行了分類，產(chǎn)生了27個(gè)OTUs，提取每個(gè)OTU的代表序列，使用MEGA 5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1）獲得OTUs相互間的遺傳距離。并將這些代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行比對(duì)，參考其的命名系統(tǒng)，獲得每個(gè)OTU的分類信息。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在獲得的線蟲動(dòng)物門的序列中，主 要 類 群 有Prismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、Criconematidae、Plectidae它們分別占總序列數(shù)的31%、15%、11%、8%、6%、5%（見圖2）。

圖1 各OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree with representatives sequence of each OTU

2.3 不同杉木人工林土壤線蟲群落組成及數(shù)量特征

在獲得各個(gè)OTUs 的分類信息后，利用Mothur提取各OTU獲得的DNA條數(shù)。并統(tǒng)計(jì)各個(gè)類群在不同類型杉木人工林中的相對(duì)豐度。

利用R軟件的ggplot2軟件包以各樣地群落的相對(duì)豐度數(shù)據(jù)，繪制群落結(jié)構(gòu)的Heatmap圖（圖3）。從圖中可以看出不同類型的杉木人工林線蟲的群落結(jié)構(gòu)差別很大。Prismatolaimidae依然是所有樣地中的優(yōu)勢類群。且在各樣地間其相對(duì)豐度變化不明顯。Aphelenchidae、Cephalobidae、Criconematidae、Rhabdolaimidae、Tylenchidae這五個(gè)類群的相對(duì)豐度在各樣地間具有顯著性差異（p＜0.05）。Aphelenchidae只在第1代杉木幼林中出現(xiàn)了。Rhabdolaimidae只在第1代杉木幼林和第1代杉木成林中出現(xiàn)。Tylenchidae 只在第1代杉木幼林和第3代杉木幼林中出現(xiàn)。Cephalobidae在第1代杉木中林中的相對(duì)豐度（0.77%）顯著小于其他樣地。而相反的，第2代杉木中林Criconematidae 的相對(duì)豐度（23.44%）卻大大的高于其他樣地。

圖2 線蟲分布比例圖Fig.2 Pie chart of nematoda taxonomical distribution

2.4 不同杉木人工林土壤線蟲群落的多樣性分析

根據(jù)每個(gè)樣地各群落的數(shù)據(jù)。借助BIO-MAP軟件我們計(jì)算了各樣地的香濃指數(shù)、麥金圖史指數(shù)、辛普森指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)、伯杰·帕克指數(shù)。并進(jìn)行了單因素方差分析，結(jié)果顯示五種不同類型的杉木人工林的各種多樣性指數(shù)之間并沒有顯著性差異。

表3 土壤線蟲的分類信息及群落組成Table 3 The classification information and Composition of soil nematode communities

表4 土壤線蟲群落多樣性分析Table 4 Soil nematode community diversity analyse

2.5 土壤線蟲群落分布與理化性質(zhì)的冗余分析

冗余分析（RDA）是指采用二維排序圖的形式展示群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因素間的關(guān)系。其可以結(jié)合多個(gè)環(huán)境因子一起分析，并能夠獨(dú)立保持各個(gè)環(huán)境變量對(duì)生物變化的貢獻(xiàn)率，其樣方排序值既反映了物種組成及生態(tài)重要值對(duì)生物的作用，同時(shí)也反映了環(huán)境因子的影響[15]。我們采用這種方法，比較了不同杉木類型杉木人工林土壤線蟲群落分布與理化性質(zhì)間的關(guān)系（圖4）。圖中五種類型的樣地間的距離代表其群

圖3 線蟲群落結(jié)構(gòu)的Heatmap圖Fig.3 Heatmap presentations of nematode community

圖4 土壤線蟲主要群落與環(huán)境解釋變量的RDA排序圖Fig.4 The ordination diagram of RDA with soil dominant nematode communities and explanatory variables

落的歐幾里得距離，長度越短表示差異越小，反之越大。因此可以得知：FRC，SYC，TYC三塊樣地的群落結(jié)構(gòu)較為相似。FYC與FRC之間距離最大，二者間的群落結(jié)構(gòu)差異性明顯。另外速效鉀、速效氮、全氮以及含水量對(duì)土壤線蟲的分布影響比較大。Chromadoridae、Dorylaimidae、Monhysteridae、Nygolaimidae、Plectidae、Rhabditidae這六種類群與pH值、速效磷、全氮、有機(jī)質(zhì)之間有比較明顯的正相關(guān)，Tripylidae、Tylenchidae與含水量之間有明顯的正相關(guān)，卻與速效鉀之間是負(fù)相關(guān)的關(guān)系。Prismatolaimidae與速效氮之間也是負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

本研究采用454焦磷酸測序技術(shù)對(duì)湖南黃豐橋國有林場的不同發(fā)育階段以及不同代際的杉木人工林土壤線蟲的群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行了比較，得到以下結(jié)果：

試驗(yàn)選取的5塊不同類型的杉木人工林共獲得了2 111條隸屬于線蟲動(dòng)物門的序列。經(jīng)聚類后產(chǎn)生了27個(gè)OTUs。主要類群有Prismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、Criconematidae、Plectidae它們分別占總序列數(shù)的31%、15%、11%、8%、6%、5%。其中Prismatolaimidae在所有樣地中均占絕對(duì)優(yōu)勢。在第1代幼林中優(yōu)勢最為明顯，相對(duì)豐度達(dá)到了38.07%。并且其在5塊樣地中的分布出現(xiàn)了一定的規(guī)律性，即在同一代的人工林中，Prismatolaimidae的相對(duì)豐度從幼齡林到成熟林。其變化趨勢是先降低再升高。在同一林齡的人工林中，Prismatolaimidae的相對(duì)豐度從1代林到3代林。其變化趨勢同樣是先降低再升高。劉麗等[16]、焦如珍等[17]和盛煒彤等[18]分別報(bào)道了不同地區(qū)杉木人工林土壤微生物數(shù)量的變化, 他們發(fā)現(xiàn)隨著杉木人工林林齡增長土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量呈先下降后上升的趨勢,并認(rèn)為植被發(fā)育和植物多樣性與土壤微生物種群及數(shù)量成正相關(guān)。同樣的對(duì)于不同代數(shù)的杉木人工林。由于土壤退化第1代要比地代細(xì)菌和真菌的更為豐富，而第3代由于進(jìn)行了一些人為的地力恢復(fù)措施。其細(xì)菌和真菌也較第2代高。根據(jù)A V Coomans[19]的描述，Prismatolaimidae是一類以細(xì)菌為食的線蟲，由此說明Prismatolaimidae類線蟲的變化是由于其食物來源的變化造成的。

從樣品的的Heatmap圖以及RDA分析中我們可以看出，所選的5塊樣地的線蟲的群落結(jié)構(gòu)有著明顯的差異，但是從多樣性的單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，各樣地的線蟲多樣性間并沒有達(dá)到顯著性差異。1992年，Walker[20]提出了“冗余種”假說。他認(rèn)為一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中存在可以維持正常功能的最小物種數(shù)，生態(tài)系統(tǒng)的物種數(shù)目到一定程度后達(dá)到飽和,其他物種對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的功能而言則是冗余的。強(qiáng)調(diào)某些物種的損失會(huì)因?yàn)槠渌锓N豐富度的轉(zhuǎn)變而得到補(bǔ)償，而生態(tài)系統(tǒng)的功能不會(huì)受到影響。而我們的樣地中，各物種的相對(duì)豐度有了很大的變化，但是多樣性并沒有大的變化。從而支持了Walker 的“冗余種”假說。

不同杉木類型杉木人工林土壤線蟲群落分布與理化性質(zhì)間的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)：速效鉀、速效氮、全氮以及含水量對(duì)土壤線蟲的分布影響比較大。Chromadoridae、Dorylaimidae、Monhysteridae、Nygolaimidae、Plectidae、Rhabditidae這六種類群與pH值、速效磷、全氮、有機(jī)質(zhì)之間有比較明顯的正相關(guān)，Tripylidae、Tylenchidae與含水量之間有明顯的正相關(guān)，卻與速效鉀之間是負(fù)相關(guān)的關(guān)系。Prismatolaimidae與速效氮之間也是負(fù)相關(guān)的關(guān)系。說明杉木人工林能夠通過改變土壤的理化性質(zhì)來影響土壤線蟲的群落分布。進(jìn)而影響森林生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)。

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Research on soil nematode community Structure an diversity of difference Cunninghamia lanceolata plantations

LI Shu-zhan, WANG Sheng-jie, LIU Jun-ang, WU Yi, HE Yuan-hao, LI he
(Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, Central South University of Forestry and Technology,Ministry of Education, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to study the function of soilnematodeand its responses to environmental changes, we used metagenome analyses of 18S rDNA gene region to identify differences in nematodecommunity structure and diversity among fifteen soil samples belonging to five differentCunninghamia lanceolateplantations. The plantations were located in Youxian County, Hunan Province in central China. The trees in these plantations were of different ages (3, 13, and 26 years) and belonged to different ecological successions(first, second, and third successions).We

a total of 2111 sequences which belonging to the phylum of nematode, Generated 27 OTUs after clustering.The dominant taxonomic groups across all samples werePrismatolaimidae、Monhysteridae、Alaimidae、Qudsianematidae、CriconematidaeandPlectidaewith each accounting for 31%、15%、11%、8%、6%、and 5%, and the group ofPrismatolaimidaewas dominant in all samples.The relative abundance of these five groups (Aphelenchidae、Cephalobidae、Criconematidae、RhabdolaimidaeandTylenchidae) have significant difference (p＜ 0.05) among the five plantations. The redundancy analysis (RDA) identified that the community structure of nematode among the five plantations were quite difference, and it was similar among the first successions with the age of 26 years、the second successions with the age of 3 years and the third successions with the age of 3 years. The largest difference occurs between the first successions with the age of 3 years and the first successions with the age of 26 years. The ANOVA analysis with 6 different diversity indices (Shannon Index、McIntosh’s Index、Simpson’s Index、Dominance Index、Evenness Index and Berger-Parker Index) show that there were no significant difference among different types ofCunninghamia lanceolataplantations.This study indicated that long term single with pure plantations could affect soilnematodecommunity, but it did not change the diversity of the population. There have species of redundancy in soil nematode.

Cunninghamia lanceolataPlantation; Nematode; Metagenome analyses; Community Structure; Diversity

S791.27

A

1673-923X(2015)10-0101-08

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.018

2014-03-04

國家林業(yè)公益性行業(yè)專項(xiàng)（101304402）

李樹戰(zhàn)，碩士，助教

劉君昂，教授，博導(dǎo)；E-mail：csuftsjw@163.com

李樹戰(zhàn)，王圣潔，劉君昂，等. 不同杉木人工林土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,35(10)： 101-108.

[本文編校：吳 彬]