吳雨龍，江海濤，王仁雷，汪振炯，華春,*

（1.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211171；2.江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，江蘇 南京 210013）

蛹蟲草基質多糖對雄性小鼠生殖毒性的影響

吳雨龍1，江海濤1，王仁雷2，汪振炯1，華春1,*

（1.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211171；2.江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，江蘇 南京 210013）

目的：探究蛹蟲草基質多糖（Cor dyceps militaris stroma polysaccharides，CMSP）對雄性小鼠生殖毒性的影響。方法：ICR雄性小鼠50 只，隨機分成5 組，設空白對照組、陽性對照組以及不同CMSP劑量（150、300、600 mg/（kg·d））組。陽性對照組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（20 mg/（kg·d）），連續(xù)5 d；實驗組小鼠灌胃不同劑量CMSP，連續(xù)灌胃30 d；空白對照組小鼠灌胃相同體積蒸餾水，定期稱質量。30 d后，頸椎脫臼法處死各組小鼠，取睪丸和附睪稱質量，計算臟器指數(shù)。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法對小鼠睪丸組織進行病理學檢查；紅細胞計數(shù)測定精子數(shù)量；中性紅活體染色法檢測精子活動率和畸形率；酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-lin ked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中睪酮（testosterone，TTE）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulat ing hormone，F(xiàn)SH）含量；免疫組化-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法（streptavidinperosidase，SP）檢測睪丸Bcl-2、Bax蛋白表達水平。結果：CMSP各劑量組小鼠體質量增長率、精子數(shù)量和精子活動率明顯高于陽性對照組（P＜0.05），精子畸形率明顯低于陽性對照組（P＜0.05），CMSP各劑量組間及其與空白對照組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CMSP各劑量組小鼠血清中TTE含量明顯高于陽性對照組（P＜0.05），LH及FSH含量顯著低于陽性對照組（P＜0.05），CMSP各劑量組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；睪丸內Bax蛋白表達量顯著低于陽性對照組（P＜0.05），而Bcl-2蛋白表達量則顯著高于陽性對照組（P＜0.05），CMSP各劑量組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：CMSP對雄性小鼠無生殖毒性作用。

蛹蟲草基質多糖；生殖毒性；雄性小鼠

蛹蟲草（Cordycep militaris (L.) Link）又名北冬蟲夏草或北蟲草，隸屬于真菌界（Kingdom Fungi），真菌門（Eumycota），子囊菌亞門（Ascomycotina），子囊菌綱（Ascomycetes），肉座菌目（Hypocreales），麥角菌科（Clavicipitaceae），蟲草屬（Cordyceps），與冬蟲夏草屬于同屬真菌，是蟲草屬的模式種[1]。蛹蟲草具有和冬蟲夏草相似的活性成分和藥理作用[2]，并且人工培養(yǎng)技術也已成熟，逐漸成為冬蟲夏草的理想替代品。有關研究表明，蛹蟲草含有蛋白質、脂類、糖類、維生素及多種微量元素，18 種氨基酸齊全；含有蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸和超氧化物歧化酶等生物活性物質，并且含量十分豐富[3-4]。

蛹蟲草可采用蠶蛹、大米、小麥等培養(yǎng)基進行人工栽培[2]，但采收過蛹蟲草的基質大多被廢棄，沒有得到有效利用，而基質中的多糖含量約為子實體中的2～4 倍，并具有較高的抗氧化活性[5-6]。蛹蟲草多糖是蛹蟲草中含量最多的藥理活性物質，是一類高分子復合物，具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、降血糖[9-10]、降血脂[11]、保肝[12]、提高免疫力[13-15]等作用，而有關蛹蟲草基質多糖對雄性生殖毒性的研究尚未見報道，生殖系統(tǒng)對毒物的作用十分敏感，在其他系統(tǒng)還未出現(xiàn)毒性反應前，生殖系統(tǒng)可能已出現(xiàn)了損害。本研究通過探究蛹蟲草基質多糖對雄性小鼠生殖毒性的影響，為提高蛹蟲草人工栽培的附加值及保健安全使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

蛹蟲草基質多糖（Cordyceps militaris stroma polysaccharides，CMSP）由南京曉莊學院生物化工與環(huán)境工程學院實驗中心提供。

雄性ICR小鼠，體質量18～25 g，揚州大學比較醫(yī)學中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2012-0004。

兔抗免疫組化試劑盒、Rabbit Anti-Bcl-2抗體、Rabbit Anti-Bax抗體 北京北化康泰臨床試劑有限公司；小鼠睪酮（testosterone，TTE）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA檢測試劑盒、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-3000旋轉蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；臺式冷凍干燥機 美國Labconco公司；高速冷凍離心機 美國熱電公司；通用酶標儀、自動洗板機 美國伯樂公司；Nikon 50i生物顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 CMSP的制備

稱取5 g采收過蛹蟲草的基質粉末，加入200 mL水，搖勻，再加入2 000 U的纖維素酶2.5 mL，調節(jié)pH值到4.8，50 ℃水浴1.5 h，再轉移到80 ℃水浴中滅酶2 h，然后再進行超聲波處理，30 ℃處理40 min，4 200 r/min離心10 min，收集上清糖液。將收集到的糖液旋轉蒸發(fā)到一定體積，采用Se vag法除蛋白，除蛋白后的糖液采用4 倍體積的95%乙醇進行醇沉，在4 ℃冰箱中醇沉24 h，經抽濾、冷凍干燥得到CMSP。

1.3.2 動物分組及給藥

取雄性ICR小鼠50 只，體質量18～25 g，在室溫（22±3）℃，相對濕度30%～70%，自由攝食、飲水的飼養(yǎng)條件下，適應性飼養(yǎng)5 d后，隨機分成5 組，每組10 只：空白對照組、陽性對照組和3 個CMSP劑量組（150、300、600 mg/（kg·d），以體質量計，下同）。CMSP劑量組小鼠每天定時灌胃給藥，連續(xù)30 d；空白對照組小鼠灌胃相同體積的蒸餾水，連續(xù)30 d；陽性對照組小鼠采用腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/（kg·d），連續(xù)5 d。

1.3.3 小鼠一般狀態(tài)觀察

實驗期間觀察小鼠的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度、死亡等情況，每周稱量小鼠體質量一次。

1.3.4 小鼠血清中TTE、LH和FSH含量的測定

30 d后，各組小鼠眼球采血，3 000 r/min離心10 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)錅y。按照ELISA試劑盒說明書方法測定血清中TTE、LH、FSH含量。

1.3.5 小鼠臟器指數(shù)的測定

眼球采血后，頸椎脫臼法處死小鼠，取兩側睪丸和附睪，用濾紙吸干睪丸和附睪組織上的血液，稱質量，并按照下式計算睪丸和附睪的臟器指數(shù)[16]。

1.3.6 小鼠精子數(shù)量、活動率及畸形率的測定

取小鼠兩側附睪，迅速轉移到37 ℃預熱的含有精子培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用手術剪刀剔除附睪上附著的脂肪組織，靜置1～2 min，將附睪轉移到另一個含精子培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。用手術刀沿附睪縱向作4～5 個深切口，將此培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中擴散5 min，去掉殘余的附睪組織，精子懸液保存在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中備用。按照下述方法檢測精子數(shù)量、精子活動率和精子畸形率。

精子數(shù)量：取兩滴搖勻的精子懸液滴入血細胞計數(shù)板，按紅細胞計數(shù)法[17]計數(shù)（107個/mL）；精子活動率：用中性紅活體染色法，計數(shù)5 個不同視野內各100 個精子，計算精子活動率；精子畸形率：取精子懸液滴于潔凈的載玻片上，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定5 min，晾干后用質量分數(shù)2%的伊紅水溶液染色1～2 h，用水輕柔沖洗，干燥，400 倍鏡檢。每只小鼠檢查完整的精子200 條，計數(shù)精子畸形率。

1.3.7 小鼠睪丸組織病理學觀察

用10%的中性甲醛溶液固定睪丸組織，采用乙醇梯度脫水，透明的二甲苯和常規(guī)石蠟對睪丸進行包埋處理，5 μm均勻切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，100 倍鏡下觀察睪丸組織形態(tài)結構的變化。

1.3.8 小鼠睪丸中Bax和Bcl-2表達量的測定

采用免疫組化-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法（streptavidin-perosidase，SP）[18]檢測小鼠睪丸中Bax和Bcl-2的表達量。組織蠟塊5 μm均勻切片、脫蠟、水化，體積分數(shù)3%的H2O2溶液滅活內源性過氧化物酶，按試劑盒說明書的操作步驟進行二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色5～8 min，水洗終止顯色反應，蘇木精輕度復染、水沖洗返藍、1%的鹽酸-乙醇分化、水沖洗，然后進行鏡檢。Bax和Bcl-2陽性產物表達于間質細胞和生精細胞的胞漿中，以及胞漿內的棕黃色顆粒。采用圖像分析系統(tǒng)進行Bax和Bcl-2表達半定量分析，即每組隨機選取10 張切片，于400 倍鏡下隨機選擇10 個生精小管，測定陽性產物的平均灰度。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 15.0軟件進行單因素方差分析，t檢驗法比較各組之間差異是否顯著，實驗結果以±s表示，顯著性水平為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 小鼠的一般狀態(tài)及體質量變化

空白對照組和CMSP各劑量組小鼠大便正常，活動敏捷，步態(tài)、行為及對外界反應情況正常，無死亡小鼠。陽性對照組小鼠均出現(xiàn)稀便、軟便，體質量增長抑制，毛色暗淡、無光澤、不順滑，精神不振，尿液顏色棕黃等現(xiàn)象。2～3 周后，小鼠稀便、軟便情況得到緩解，各組均無死亡小鼠。其中陽性對照組小鼠反應明顯遲緩。

圖1 CMSP對雄性小鼠體質量增長的影響Fig.1 Effect of CMSP on body weight gain in male mice

如圖1所示，與空白對照組和CMSP各劑量組比較，陽性對照組小鼠體質量增長被抑制，CMSP各劑量組間及其與空白對照組間均無顯著差異（P＞0.05），與陽性對照組間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 CMSP對雄性小鼠血清性激素水平的影響

如圖2所示，空白對照組和CMSP各組小鼠TTE含量均顯著高于陽性對照組（P＜0.05），除陽性對照組外，各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；空白對照組和CMSP各劑量組LH、FSH含量均顯著低于陽性對照組（P＜0.05），除陽性對照組外，各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 CMSP對雄性小鼠血清TTE、LH、FSH含量的影響Fig.2 Effect of CMSP on serum TTE, LH and FSH in male mice

2.3 CMSP對雄性小鼠臟器指數(shù)的影響

圖3 CMSP對雄性小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.3 Effect of CMSP on viscera indices of male mice

如圖3所示，CMSP各劑量組小鼠的睪丸、附睪質量，睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)與空白對照組比較，均無顯著差異（P＞0.05），與陽性對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 CMSP對雄性小鼠精子數(shù)量、活動率、畸形率的影響

圖4 CMSP對雄性小鼠精子數(shù)量、活動率、畸形率的影響Fig.4 Effect of CMSP on sperm count, sperm motility and sperm malformation rate of male mice

如圖4所示，與陽性對照組比較，空白對照組和CMSP各劑量組小鼠的精子數(shù)量明顯增多（P＜0.05），除陽性對照組外，各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與陽性對照組比較，空白對照組和CMSP各劑量組小鼠的精子活動率明顯升高（P＜0.05），除陽性對照組外，各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與陽性對照組比較，空白對照組和CMSP各劑量組小鼠的精子畸形率明顯降低（P＜0.05），除陽性對照組外，各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。小鼠各種不同的精子形態(tài)見圖5。

圖5 小鼠不同類型精子形態(tài)（×400）Fig.5 Different types of sperm morphology (× 400)

圖6 CMSP對雄性小鼠睪丸組織結構的影響（×100）Fig.6 Effect of CMSP on the structure of testis tissue (× 100)

2.5 CMSP對雄性小鼠睪丸組織結構的影響

如圖6所示，空白對照組小鼠的生精細胞形態(tài)正常，排列整齊，生精細胞層數(shù)完整，間質細胞和支持細胞形態(tài)正常，生精小管基膜連續(xù)、完整（圖6A）。陽性對照組小鼠的生精細胞間隙增大、部分缺失，生精細胞層明顯減少、變薄，間質細胞部分消失，生精小管支持細胞缺失，生精小管內結構雜亂，無正常結構，也無精子，管腔內出現(xiàn)空泡（圖6C）。CMSP 600 mg/（kg·d）組小鼠的生精細胞形態(tài)正常，各級生精細胞清晰可見，間質細胞和支持細胞形態(tài)均正常，管腔均勻（圖6B）。

2.6 CMSP對雄性小鼠睪丸中Bax和Bcl-2表達水平的影響

圖7 CMSP對小鼠睪丸間質細胞中Bax和Bcl-2相對表達量的影響Fig.7 Effect of CMSP on Bax and Bcl-2 expression in testicular interstitial cells of mice

如圖7所示，CMSP各劑量組小鼠的睪丸間質細胞及生精細胞內均可檢測到Bax、Bcl-2的表達，主要表達于間質細胞的胞漿中，精原細胞和精母細胞的胞漿中也有所表達?？瞻讓φ战M和CMSP各劑量組小鼠的Bax相對表達量明顯低于陽性對照組（P＜0.05），Bcl-2相對表達量明顯高于陽性對照組（P＜0.05），除陽性對照組外，各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Bax和Bcl-2在小鼠睪丸中的表達形態(tài)見圖8、9。

圖8 CMSP對雄性小鼠睪丸Bax表達的影響（×400）Fig.8 Effect of CMSP on the expression of Bax in testes of male mice (× 400)

圖9 CMSP對雄性小鼠睪丸Bcl-2表達的影響（×400）Fig.9 Effect of CMSP on the expression of Bcl-2 in testes of male mice (× 400)

3 討 論

多糖是蛹蟲草中的主要活性成分之一，其含量豐富，是進行蛹蟲草開發(fā)利用的主要功能性物質，具有抗癌、抗糖尿病、抗腫瘤和保肝等作用[19]。深化蛹蟲草多糖的研究，有助于進一步開發(fā)蛹蟲草多糖相關的保健食品和治療藥物。

睪丸是雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分之一，其中80%為生殖小管[20]。正常情況下，生精小管管壁中，由外到內是精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞、分化中的精子、成熟精子。成熟精子隨后進入管腔，在附睪內精子進一步成熟并獲得運動能力[21]。睪丸的功能除了產生成熟的精子外，還能合成并分泌雄性激素。因此，睪丸的正常形態(tài)對維持睪丸功能的正常至關重要。本研究結果表明，CMSP各劑量組小鼠的睪丸質量、附睪質量、睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)明顯高于陽性對照組，其中CMSP 600 mg/（kg·d）組小鼠的相關指標甚至高于空白對照組；CMSP各劑量組小鼠的精子數(shù)量和精子活動率明顯高于陽性對照組，精子畸形率明顯低于陽性對照組，且CMSP 600 mg/（kg·d）組小鼠的精子數(shù)量和精子活動率甚至高于空白對照組，精子畸形率低于空白對照組；HE染色結果表明，CMSP 600 mg/（kg·d）組小鼠的睪丸間質細胞和生精上皮細胞無損傷。因此CMSP對雄性小鼠的睪丸、附睪、睪丸間質細胞和各級生精細胞無毒性作用。

睪丸分泌的最主要雄性激素為TTE，約占血漿中TTE總量的95%。TTE進入曲細精管，與生精細胞內的TTE受體結合，對促進精子的生成和刺激生殖器官的發(fā)育等有重要的作用。臨床上TTE缺乏的患者表現(xiàn)為原發(fā)性無精子或精子發(fā)生完全停止[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，CMSP灌胃雄性小鼠30 d后，雄性小鼠的血清TTE水平與陽性對照組差異顯著，而與空白對照組無明顯差異，且CMSP 300、600 mg/（kg·d）組小鼠的血清TTE水平略高于空白對照組。以上結果提示CMSP對雄性小鼠TTE分泌無抑制作用。

TTE的分泌有基礎分泌和促性腺激素誘導分泌兩種形式，后者受下丘腦-垂體-性腺軸的調節(jié)。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素，經垂體門脈系統(tǒng)作用于促性腺激素細胞，使之分泌LH和FSH。LH和FSH再經血液運輸?shù)讲G丸，與睪丸內細胞上的受體結合，促使間質細胞內TTE的合成。當血液中TTE含量升高到一定程度后，TTE又以負反饋方式作用于下丘腦-垂體-性腺軸，從而抑制促性腺激素釋放激素、LH和FSH，保證血液中TTE的含量維持在一定的水平[23]。本研究中，灌胃CMSP的雄性小鼠血清中TTE含量與陽性對照組比較顯著上升，TTE對下丘腦-垂體-性腺軸的負反饋抑制增強，所以小鼠血清中LH 和FSH的含量顯著下降，而與空白對照組比較無顯著差異。以上結果提示CMSP對LH和FSH的分泌無影響。

睪丸生殖細胞的凋亡和細胞的增殖分化受到多種基因的控制。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調控基因，Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中兩個典型的促凋亡和抑凋亡蛋白，且二者通過形成同源或異源二聚體來調節(jié)細胞凋亡[24]。近年來的研究提示，Bax和Bcl-2這兩種蛋白均參與了生精細胞凋亡的過程[25-26]。本研究結果顯示，雖然Bax在睪丸間質細胞、支持細胞和精母細胞中有表達，但均為陰性表達，而CMSP各劑量組小鼠睪丸中的Bcl-2蛋白表達顯著高于陽性對照組。以上結果提示CMSP對雄性小鼠睪丸生殖細胞無促凋亡作用。

綜上所述，CMSP對雄性小鼠無生殖毒性作用，在食品保健和治療藥物方面具有較好的開發(fā)應用前景。

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Reproductive Toxicity Risk Assessment for Polysaccharides from Cordycep s militaris Stroma in Male Mice

WU Yulong1, JIANG Haitao1, WANG Renlei2, WANG Zhenjiong1, HUA Chun1,*
(1. School of Food Science, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China; 2. School of Life Science and Chemistry, Jiangsu Second Normal University, Nanjing 210013, China)

Objective: To explore the effect of Cordyceps militaris stroma polysaccharides (CMSP) on reproductive toxicity in male mice. Methods: Totally 50 ICR male mice were randomly divided in to fi ve groups including blank control group, positive control group, and CMSP treatment groups at different doses (150, 300 and 600 mg/( kg·d)). The mice from positive control group were administered with cyclophosphamide at a dose of 20 mg/(kg·d) for 5 days via intraperitoneal injection. The mice from CMSP treatment groups were administered with CMPS at various doses for 30 days. The mice from blank control group were administered with an identical volume of distilled water via gavage. After 30 days, the mice from each group were sacrifi ced by cervical dislocation, the harvested testes and epididymides were weighed and organ indices were calculated. HE staining was applied for pathological examination of testes, the number of sperm was detected by red blood cell counting method, eosin staining method was used to detect sperm motility and abnormality, the serum concentrations of testosterone (TTE), luteinizing hormone (LH), follicle-stimulating hormone (FSH) were assessed by ELISA, and immunohistochemical SP method was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax protein in testes. Results: Weight growth rate, sperm count and sperm motility in the treatment group s were signifi cantly higher than in the positive control group (P ＜ 0.05). Sperm malformation rate in the treatment groups was signifi cantly lower than in the positive control group (P ＜ 0.05) although no obvious statistical signifi cance was observed among the treatment and blank control groups (P ＞ 0.05). The se rum level of TTE in the treatment groups was signifi cantly higher than that in the positive control group (P ＜ 0.05),and LH and FSH were signifi cantly lower than those in the positive control group (P ＜ 0.05), but there was no statistical difference among the treatment groups. The expression level of Bax protein in testes from the treatment groups was signifi cantly lower than that in the positive control group (P ＜ 0.05), while the expression level of Bcl-2 was signifi cantly higher than that in the positive control gr oup (P ＜ 0.05); however, there was no statistically signifi cant differ ence among the treatment groups (P ＞ 0.05). Conclusion: CMSP has no obvious toxicity to the reproductive system of male mice.

Cordyceps militaris stroma polysaccharides (CMSP); reproductive toxicity; male mice

TS201.2

A

1002-6630（2015）19-0227-06

10.7506/spkx1002-6630-201519041

2014-11-18

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA021701）；國家自然科學基金面上項目（21376112）；江蘇省自然科學基金面上項目（BK2014020929）

吳雨龍（1980-），男，講師，博士研究生，研究方向為毒理學和藥理學。E-mail：xiaoyatou422@sina.com

*通信作者：華春（1963-），女，教授，本科，研究方向為植物生理生化。E-mail：hc3501988@163.com