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        應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)探究長根菇多糖對小鼠腸道菌群的影響

        2015-12-20 07:56:43趙龍玉趙鳳春張圣方楊正友
        食品科學(xué) 2015年19期
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量

        王 雪,趙龍玉,趙鳳春,張圣方,楊正友

        (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室,山東 泰安 271018)

        應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)探究長根菇多糖對小鼠腸道菌群的影響

        王 雪,趙龍玉,趙鳳春,張圣方,楊正友*

        (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室,山東 泰安 271018)

        本研究采用Illumina高通量測序技術(shù)檢測長根菇多糖對昆明小鼠腸道菌群的影響。利用鹽酸林可霉素灌胃建立腸道微生態(tài)失調(diào)小鼠模型。將60 只小鼠隨機(jī)分為5組:空白對照組、自然恢復(fù)組、長根菇多糖低劑量組、長根菇多糖中劑量組和長根菇多糖高劑量組。無菌條件下采集小鼠盲腸內(nèi)容物,運(yùn)用Illumina高通量測序技術(shù)分析各組小鼠盲腸內(nèi)容物中菌群的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:空白對照組小鼠腸道菌群物種多樣性最高,長根菇多糖各劑量組次之,自然恢復(fù)組最低;另外,各組小鼠腸道有益菌與致病菌比例差異顯著,長根菇多糖各劑量組有益菌群相對比例高于自然恢復(fù)組,而自然恢復(fù)組小鼠腸道中致病菌比例最高。長根菇多糖對小鼠的腸道菌群失調(diào)具有恢復(fù)和改善作用。

        長根菇;多糖;腸道菌群;高通量測序

        長根菇(Oudemansiella radicate),又名長根小奧德蘑、長根金錢菌,隸屬于真菌界,擔(dān)子菌門,傘菌綱,傘菌目,膨湖菌科,小奧德蘑屬[1]。其子實體肉質(zhì)鮮嫩,味美可口。長根菇的子實體、菌絲體及菌絲體發(fā)酵液中含有多種藥用成分,有益于人體健康,如長根菇多糖具有抗病毒、抗腫瘤[2]、降低機(jī)體膽固醇含量及防止動脈硬化[3]的作用,而長根菇素有降壓[4]等功效。長根菇作為一種食藥兩用的名貴真菌,具有巨大的開發(fā)潛力。

        在人和動物體內(nèi),腸道正常微生物平衡、腸黏膜上皮屏障以及腸道免疫系統(tǒng)為正常腸道屏障功能提供了保障[5]。數(shù)量龐大的腸道菌群對宿主具有營養(yǎng)、免疫和生物拮抗等作用[6]。鹽酸林可霉素(lincomycin hydrochloride,LIH)是臨床常用抗菌藥物,對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用[7]?,F(xiàn)今,抗菌藥物使用不當(dāng)已經(jīng)成為引起腸道菌群失調(diào)的最常見誘因[8]。抗菌藥物對腸道菌群的影響主要表現(xiàn)在敏感菌被大量殺死,而耐藥菌大量繁殖,比例超出正常水平,各種菌群大幅度變化,特別是原籍菌群數(shù)量和密度下降,而外籍菌和環(huán)境菌群數(shù)量和密度升高[9]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),真菌多糖具有改善動物體內(nèi)腸道微生態(tài)的作用[10]。

        腸道微生物研究的主要障礙是腸道菌群的鑒定技術(shù),早期腸道菌群的研究主要建立在傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上[11-12]。傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)準(zhǔn)確率低、局限性大,只能檢測培養(yǎng)型微生物[13],而大多數(shù)的腸道菌群為非培養(yǎng)型菌[14],培養(yǎng)型細(xì)菌只占腸道菌群的1%~10%[15]。近年來,分子生物學(xué)技術(shù)在微生物群落分析上的應(yīng)用愈加廣泛,包括熒光原位雜交[16]、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)[17]、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)[18]、構(gòu)建克隆文庫[19]等。然而這些傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)具有其局限性,不能完整地反映整個群落的結(jié)構(gòu)信息,且耗時長、工作量大。與之相比,高通量測序技術(shù)對微生物群落信息的采集與分析更準(zhǔn)確、詳細(xì)[20]。高通量測序技術(shù)在腸道微生物的研究中已有應(yīng)用,它使研究人員對腸道菌群的構(gòu)成有了更加全面的認(rèn)識。

        本實驗使用鹽酸林可霉素構(gòu)建腸道菌群失調(diào)小鼠模型,對小鼠進(jìn)行長根菇多糖灌胃實驗,采用Illumina高通量測序技術(shù)對小鼠腸道菌群進(jìn)行研究,探究長根菇多糖對腸道菌群的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與動物

        長根菇購自四川省綿陽市食用真菌研究所。

        鹽酸林可霉素注射液(300 mg/mL) 河南福森藥業(yè)有限公司;土壤基因組DNA提取試劑盒 美國Omega生物技術(shù)公司;AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒美國Axygen公司。

        清潔級雄性昆明小鼠,體質(zhì)量(20±2) g,由泰山醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫(25±1) ℃,相對濕度(55±10)%,燈光控制12 h晝夜交替。

        1.2 儀器與設(shè)備

        LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;TGL-16B型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;WSZ-160A型漩渦振蕩器 上海一恒科技有限公司;K5600超微量核酸蛋白檢測儀 北京凱奧科技發(fā)展有限公司;751G型紫外分光光度計 美國Amersham Biosciences公司;QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司。

        1.3 方法

        1.3.1 長根菇多糖的制備

        菌種活化后接種于液體培養(yǎng)基,26 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d后,3 600 r/min離心去除菌絲體,收集發(fā)酵液。將獲得的發(fā)酵液采用乙醇沉淀法提取粗多糖。粗多糖依次經(jīng)Sevag法脫蛋白、活性炭除色素、透析除小分子雜質(zhì),最終得到精制的長根菇胞外多糖。用苯酚-硫酸法[21]對長根菇多糖進(jìn)行定量測定。

        1.3.2 動物分組、造模和給藥

        從60 只清潔級雄性昆明小鼠中隨機(jī)取出12 只作為空白對照組,剩余48 只用鹽酸林可霉素(300 mg/mL)灌胃造模,每次0.3 mL,2 次/d,連續(xù)灌胃3 d。以小鼠出現(xiàn)溏便、背毛失去光澤、行動遲緩為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。空白對照組小鼠灌胃相同體積的生理鹽水。造模成功后,將模型組小鼠隨機(jī)均分為4 組:自然恢復(fù)組、3 個不同劑量長根菇多糖組。飼養(yǎng)期間,供給充足的飼料和飲水供小鼠自由攝取。按照表1的方案,每天使用生理鹽水或不同質(zhì)量濃度長根菇多糖溶液對小鼠進(jìn)行定時灌胃,連續(xù)灌胃14 d。

        表1 小鼠分組和給藥方案Table 1 Animal grouping and drug administration of experimental mice

        1.3.3 樣品采集

        最后一次灌胃24 h后處死小鼠,將小鼠固定于解剖板,常規(guī)消毒,正中剖開腹腔,無菌收集回盲部末端10 cm以內(nèi)的盲腸內(nèi)容物,置于干燥的滅菌試管中。

        1.3.4 腸道菌群DNA提取和Illumina高通量測序

        分別取5 個盲腸內(nèi)容物的糞便樣本,采用土壤基因組DNA提取試劑盒提取小鼠糞便樣品微生物的總DNA,具體步驟按說明書操作。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。所提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對樣品進(jìn)行16S rRNA基因V4區(qū)的PCR擴(kuò)增及Illumina高通量測序。

        針對16S rRNA基因V4區(qū),合成帶有barcode的特異引物。PCR擴(kuò)增采用TransGen AP221-02: TransStartFastpfu DNA聚合酶反應(yīng)體系。每個樣品3 個重復(fù),將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris-HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量,之后進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。測序得到的PE reads(paired-end reads)首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾,區(qū)分樣品后利用Mothur軟件對序列進(jìn)行OTU聚類,用于樣品間的相似性分析,并繪制樣品的稀疏曲線,計算樣品的alpha多樣性。Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析,包括ACE值、Chaol值、Shannon指數(shù)等。Chaol值和ACE值是根據(jù)所測得的OTU數(shù)量預(yù)測樣品中微生物的種類,Shannon指數(shù)是一個多樣性指數(shù),Shannon指數(shù)越大,則表示該樣品中的物種越豐富。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,顯著性分析采用單因素方差分析,顯著水平α=0.05,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 長根菇多糖提取結(jié)果

        依據(jù)苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 0.013x-0.003,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算經(jīng)脫蛋白、脫色素、透析除小分子后,精制的長根菇多糖純度為79.71%。

        2.2 小鼠腸道菌群物種豐度及多樣性

        表2 各組小鼠腸道菌群的OTU數(shù)量及alpha多樣性Table 2 OTU number and alpha diversity of intestinal microbiota in different groups of mice

        利用Mothur軟件計算在97%的相似水平上每個樣品的OTU數(shù)量,OTU數(shù)量可以代表樣品物種的豐度[22]。由表2可知,在所有樣品中,OTU數(shù)量最多可達(dá)到290,最少為199。這表明小鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的豐度很高,并且樣品之間微生物豐度差異較大。同時alpha多樣性分析也表明,空白對照組多樣性指數(shù)最優(yōu)(ACE值和Chaol值最高,Shannon指數(shù)最低),自然恢復(fù)組ACE值和Chaol值最低,這說明給小鼠灌胃長根菇多糖后,其腸道微生物多樣性高于自然恢復(fù)組但低于空白對照組,且長根菇多糖中劑量組小鼠腸道菌群豐度在長根菇多糖各劑量組中最高。Alpha多樣性指數(shù)ACE值、Chaol值及Shannon指數(shù)在空白對照組、自然恢復(fù)組和長根菇多糖中劑量組之間差異顯著(P<0.05)。

        圖1 腸道菌群的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curve analysis of intestinal microfl ora

        由圖1可知,當(dāng)測序數(shù)據(jù)量相同時,長根菇多糖各劑量組小鼠的腸道菌群OTU數(shù)量比空白對照組低,但高于自然恢復(fù)組,長根菇多糖中劑量組小鼠的腸道菌群OTU數(shù)量高于另外兩個長根菇多糖組,表明長根菇多糖各劑量組小鼠的腸道菌群多樣性低于空白對照組但高于自然恢復(fù)組,長根菇多糖中劑量組小鼠的腸道菌群多樣性在長根菇多糖各劑量組中最高,說明鹽酸林可霉素對小鼠腸道菌群產(chǎn)生了影響,長根菇多糖對小鼠的腸道菌群失調(diào)有恢復(fù)作用,且中劑量長根菇多糖效果最好。

        2.3 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

        圖2 小鼠腸道菌群在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of mouse intestinal microflora at the level of phylum

        通過對所有樣品中微生物的16S rRNA基因V4區(qū)序列進(jìn)行Illumina測序,共檢測到8 個菌門。其中所有樣品88.95%以上都是由厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成。由圖2可知,自然恢復(fù)組的小鼠腸道中擬桿菌門含量最高、厚壁菌門含量最低,在腸道菌群中所占的相對比例分別為64.87%和29.67%;長根菇多糖各劑量組的小鼠腸道中擬桿菌門含量均低于空白對照組,且隨著多糖劑量的增大而降低,其中長根菇多糖高劑量組的小鼠腸道中擬桿菌門含量相對空白對照組降低了15.64%,長根菇多糖各劑量組的小鼠腸道中厚壁菌門含量均高于空白對照組且與多糖劑量成正比,其中長根菇多糖高劑量組的小鼠腸道中厚壁菌門含量相對空白對照組升高了7.39%。

        對小鼠腸道菌群在綱的水平和屬的水平進(jìn)行深入分析,能更清晰地得出各組小鼠腸道中有益菌和有害菌的變化趨勢。芽孢桿菌綱(Bacilli)在自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中含量最低,在長根菇多糖高劑量組小鼠腸道菌群中含量最高,所占的比例分別為8.29%和14.68%,且隨長根菇多糖劑量升高有上升趨勢。自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中梭菌綱(Clostridia)含量相對于空白對照組提高了85.94%,長根菇多糖中、低劑量組小鼠腸道菌群中梭菌綱含量低于空白對照組。Allobaculum屬、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和乳桿菌屬(Lactobacillus)在自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中含量最低,其中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬含量分別低于空白對照組79.96%和39.54%,而在長根菇多糖各劑量組小鼠腸道菌群中含量均有較大程度提高,雙歧桿菌屬在長根菇多糖低、中劑量組小鼠腸道菌群中含量已恢復(fù)至空白對照組水平,乳桿菌在長根菇多糖各劑量組小鼠腸道菌群中含量均已恢復(fù)至空白對照組水平,在長根菇多糖高劑量組小鼠腸道菌群中含量高于空白對照組。在自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中未檢測到瘤胃球菌屬(Ruminococcus),其余4 組中均含有此菌群。脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)在長根菇多糖中劑量組小鼠腸道菌群中含量最低,低于空白對照組48.89%。

        3 討 論

        正常微生物菌群[23]大量棲居于健康動物的體表和體內(nèi),與宿主機(jī)體之間處于一種動態(tài)平衡狀態(tài),與此同時,不同菌群之間也保持著一定的比例關(guān)系,菌群的平衡與穩(wěn)定對機(jī)體的各項生理功能具有重要的影響,例如它們在營養(yǎng)消化吸收、免疫拮抗等方面發(fā)揮著重要作用[24]??咕幬镌谡鞣腥镜亩窢幹邪l(fā)揮了巨大的作用,但是它所帶來的危害也不容小覷,其主要副作用之一就是對腸道微生態(tài)的影響,破壞了正常的微生物菌群平衡,使得原來呈弱勢的致病菌含量上升,繼而出現(xiàn)腹瀉等一系列問題。Illumina高通量測序技術(shù)又稱為新一代測序技術(shù),是一種采用專有的可逆終止子化學(xué)方法對數(shù)百萬片段進(jìn)行大規(guī)模測序的新型測序技術(shù)[13]。該技術(shù)是目前應(yīng)用于腸道微生物研究的前沿技術(shù)。

        本研究通過Illumina測序技術(shù)檢測小鼠糞便中微生物組成和結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)不同樣品中物種豐度存在差異,不同組小鼠腸道菌群的變化呈現(xiàn)一定規(guī)律。Bezirtzoglou 等[25]的研究結(jié)果顯示在人類腸道中的優(yōu)勢菌群分別是Bacteroidetes和Firmicutes這2 個細(xì)菌門,本實驗中小鼠腸道優(yōu)勢菌群研究結(jié)果與其一致。腸道菌群多樣性分析表明,空白對照組小鼠腸道菌群多樣性最高,其次為長根菇多糖中劑量組,自然恢復(fù)組最低,說明抗生素的使用降低了小鼠腸道菌群的多樣性,而長根菇多糖對小鼠腸道菌群的恢復(fù)具有顯著作用,但這種恢復(fù)作用并不是隨著多糖劑量的增大而升高,中劑量長根菇多糖的恢復(fù)作用最好。本研究發(fā)現(xiàn),自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中擬桿菌門含量最高,而長根菇多糖各劑量組小鼠腸道菌群擬桿菌門含量低于空白對照組。厚壁菌門含量隨長根菇多糖劑量增大而升高,自然恢復(fù)組最低。芽孢桿菌綱、Allobaculum屬、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和瘤胃球菌屬等在自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中含量最低,在長根菇多糖各劑量組小鼠腸道菌群中則均有較大程度提高,甚至超過空白對照組含量。梭菌綱和脫硫弧菌屬在自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中含量最高,長根菇多糖組小鼠腸道菌群中梭菌綱和脫硫弧菌含量則接近或低于空白對照組。小鼠腸道中的擬桿菌門主要為擬桿菌綱(Bacteroidia),有時能夠成為病原菌,引起闌尾炎或敗血癥等病癥。厚壁菌門在腸道中能夠幫助多糖發(fā)酵,芽孢桿菌綱是厚壁菌門的一綱,包含有芽孢桿菌目和乳桿菌目2 目,其下包含有芽孢桿菌屬等革蘭氏陽性菌,在維持動物腸道健康中起重要作用。Allobaculum屬具有腸道保護(hù)功能,瘤胃球菌屬能夠幫助腸道消化吸收糖類。在自然恢復(fù)組小鼠腸道菌群中含量明顯多于其他組的梭菌綱能夠引起院內(nèi)感染相關(guān)的致病菌定殖,另一種脫硫弧菌屬則是能夠產(chǎn)內(nèi)毒素的腸道致病菌。

        本研究結(jié)果顯示,長根菇多糖能夠增加小鼠腸道菌群的豐度,并且對使用抗生素造成的腸道菌群紊亂具有調(diào)整恢復(fù)作用,在一定程度上增加有益菌群的數(shù)量,抑制致病菌的生長。

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        Effect of Oudemansiella radicate Polysaccharide on Intestinal Microbiota in Mice Evaluated by Illumina High-Throughput Sequencing

        WANG Xue, ZHAO Longyu, ZHAO Fengchun, ZHANG Shengfang, YANG Zhengyou*
        (Shandong Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

        The effect of Oudemansiella radicate polysaccharide (ORP) on the intestinal microbiota in Kunming male mice was studied by Illumina high-throughput sequencing in this investigation. The mouse model of intestinal dysbiosis was established by intragastric administration of lincomycin hydrochloride. Sixty mice were randomly divided into fi ve groups including normal control group, natural recovery group and three groups treated with Oudemansiella radicate polysaccharide at different doses. Cecal contents were collected aseptically, and the intestinal microbiota was detected by illumina highthroughput sequencing. The results showed that the diversity and abundance of intestinal bacteria were varied in the mice in the fi ve groups. Among these, the normal control group had the highest intestinal microbiota diversity followed by the ORP treatment groups, and the intestinal microbiot a of the natural recovery group exhibited the lowest species diversity. In addition, the proportions of benefi cial and pathogenic bacteria in the mouse intestine differed signifi cantly among the fi ve groups; the proportion of benefi cial bacteria was higher in the three treatment groups than in the two other groups and the highest proportion of pathogenic bacteria was observed in the natural recovery group. indicating that Oudemansiella radicate polysaccharide could improve and recover the intestinal microbiota of mice with intestinal dysbiosis.

        Oudemansiella radicate; polysaccharide; intestinal microbiota; high-throughput sequencing

        Q507

        A

        1002-6630(2015)19-0222-05

        10.7506/spkx1002-6630-201519040

        2014-11-18

        國家自然科學(xué)基金面上項目(30972050;31271873);山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2010CM015)

        王雪(1989-),女,碩士研究生,研究方向為食品微生物學(xué)。E-mail:luoxueqingchen@163.com

        *通信作者:楊正友(1971-),男,教授,博士,研究方向為食品質(zhì)量與安全、食品微生物學(xué)。E-mail:zhyou21cn@sdau.edu.cn

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