謝皓波，彭樹(shù)林，門(mén)思琦，明輝輝，林美珍，魏 寧，彭 仁

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

響應(yīng)面法優(yōu)化植物內(nèi)生菌產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件

謝皓波，彭樹(shù)林，門(mén)思琦，明輝輝，林美珍，魏 寧，彭 仁*

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

糖尿病是一種多病因的代謝疾病，α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類治療糖尿病的藥物。本研究利用植物內(nèi)生菌蠟狀芽孢桿菌SD6進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件。Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果表明：葡萄糖質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)速與溫度對(duì)發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率影響顯著，可信度在90%以上。然后釆用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果表明：最優(yōu)條件為葡萄糖質(zhì)量濃度48.05 g/L、轉(zhuǎn)速200.44 r/min、溫度27.42 ℃。α-葡萄糖苷酶抑制率的最優(yōu)理論值為39%。在優(yōu)化的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得α-葡萄糖苷酶抑制率的實(shí)際值為38.52%。模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的吻合度高，說(shuō)明該模型可以很好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

響應(yīng)面法；α-葡萄糖苷酶抑制劑；植物內(nèi)生菌

糖尿病是一種多病因的代謝疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂[1]。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2000年全球共有1.5 億例糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2025年將突破3 億例，因此糖尿病的治療已經(jīng)成為全球性的衛(wèi)生保健問(wèn)題[2]。

目前，治療糖尿病的常見(jiàn)藥物主要有胰島素及其類似物、胰島素增敏劑和胰島素分泌促進(jìn)劑等。這些藥物雖能在短期內(nèi)達(dá)到降糖的目的，但長(zhǎng)期服用此類藥物會(huì)加速胰島組織的老化，損害身體各種器官，從而誘發(fā)并發(fā)癥[3]。α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的另一類藥物。α-葡萄糖苷酶抑制劑依其來(lái)源主要?jiǎng)澐譃槿箢悾何⑸锎x產(chǎn)物、天然產(chǎn)物提取物及人工化學(xué)合成的抑制劑[4]。目前用于臨床的來(lái)源于微生物的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要有德國(guó)拜耳公司研制的阿卡波糖和米格列醇及日本武田制藥公司研制的伏格列波糖[5-7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者從各種中草藥中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，他們發(fā)現(xiàn)具有葡萄糖苷酶抑制活性的中草藥主要有杜仲、桑葉、虎杖、大黃、知母、茶葉、五味子、山茱萸等[8]。此外，Hohenschutz等[9]首次從栗豆樹(shù)的種子中提取到澳栗精胺，它也具有葡萄糖苷酶抑制活性。Wu Ya等[10]合成出來(lái)一系列含有羥基、羥甲基和雜原子環(huán)的異甜菊醇類化合物。該類化合物具有中等到強(qiáng)烈的葡萄糖苷酶抑制活性，其中一種吲哚衍生物的抑制活性最強(qiáng)，可作為合成葡萄糖苷酶抑制劑的前體物質(zhì)。在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法中，微生物發(fā)酵法具有發(fā)酵周期短、清潔生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。為了擴(kuò)大制備α-葡萄糖苷酶抑制劑的菌種來(lái)源，本研究在前期工作中首次從栗豆樹(shù)種子中篩選到一株能產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的內(nèi)生菌蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）SD6[11]。為了進(jìn)一步提高該菌產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的能力，本研究用響應(yīng)面法優(yōu)化該菌產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件，為今后利用該菌開(kāi)發(fā)新的α-葡萄糖苷酶抑制劑奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

B. cereus SD6，從栗豆樹(shù)種子中分離得到，現(xiàn)保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2015304，該菌株的16S rDNA序列在GenBank的登錄號(hào)為KF668650。

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%、KNO31%、K2HPO40.5%、MgSO4·7H2O 0.5%、NaCl 0.5%、FeSO4·H2O 0.001%、瓊脂2%（以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），pH值調(diào)至7.4～7.6。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.1%、(NH4)2SO40.55%、NaCl 0.3%、K2HPO40.1%、MgSO40.1%，pH值調(diào)至7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.1%、(NH4)2SO40.55%、NaCl 0.3%、K2HPO40.1%、MgSO40.1%，pH值調(diào)至7.0～7.2。

4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG） 上海寶曼生物科技有限公司；活性干酵母 廣東丹寶利酵母有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 B. cereus SD6生長(zhǎng)曲線測(cè)定[12]

將B. cereus SD6接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3～4 h取樣測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶的制備[13]

活性干酵母內(nèi)的α-葡萄糖苷酶活性較高，因此用它制備α-葡萄糖苷酶。稱取10 g活性干酵母，少許水研磨30 min，補(bǔ)足水至200 mL，5 000 r/min離心10min，得到的上清液為α-葡萄糖苷酶溶液。

1.3.3 發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定

α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定參考Chapdelaine等[14]的方法。在試管中分別加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，pH 6.8）1 500 μL、α-葡萄糖苷酶溶液150 μL、發(fā)酵液300 μL，37 ℃孵育10 min。再加入0.116 mol/L底物pNPG 150 μL，37 ℃反應(yīng)10 min，最后加入0.1 mol/L碳酸鈉溶液3 000 μL終止反應(yīng)。由于發(fā)酵液含有色素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此每個(gè)樣品還要測(cè)定背景吸收，其中以PBS代替底物溶液進(jìn)行測(cè)定。為了計(jì)算出抑制率，還需要測(cè)定不加發(fā)酵液（即以PBS代替發(fā)酵液）時(shí)反應(yīng)體系在410 nm波長(zhǎng)處的吸光度。發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的計(jì)算公式如下：

式中：A1為不加發(fā)酵液體系的吸光度；A2為加發(fā)酵液體系的吸光度；A3為背景吸光度。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件[15]

1.3.4.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)B. cereus SD6生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)素的基本原則和發(fā)酵影響一般規(guī)律，參考B. cereus SD6的生長(zhǎng)曲線，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)[11]，本研究使用N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度、硫酸銨質(zhì)量濃度、初始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速5 個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素選兩水平，響應(yīng)值為α-葡萄糖苷酶抑制率。另設(shè)3 個(gè)虛擬列，以考察試驗(yàn)誤差。

1.3.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分接近真實(shí)情形，所以要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程，由Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)主要因素的最陡爬坡路徑，根據(jù)主要因素效應(yīng)正負(fù)、大小的比例設(shè)定它們的變化方向與步長(zhǎng)，從而快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域。

1.3.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)確定因素與水平，釆用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。包括12 個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和3 個(gè)中心組合試驗(yàn)。響應(yīng)面優(yōu)化二階回歸分析模型為：

利用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并求出最優(yōu)影響因子水平。

1.3.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行B. cereus SD6發(fā)酵培養(yǎng)，驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)實(shí)際值的吻合度。

2 結(jié)果與分析

2.1 B. cereus SD6的生長(zhǎng)曲線

在微生物生長(zhǎng)曲線中，微生物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物多在對(duì)數(shù)期末期或穩(wěn)定期。通過(guò)測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線可以為優(yōu)化微生物的發(fā)酵條件提供指導(dǎo)[16]。B. cereus SD6的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。B. cereus SD6的遲滯期是11 h，在第14小時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖1 1 B. cereus reus SD6的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus cereus SD6

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)篩選結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算得出各因素的t值和比較得出可信度水平。一般選擇可信度＞90%的因素作為主要影響因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見(jiàn)表2。由各因素效應(yīng)分析結(jié)果可知：在B. cereus SD6產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑過(guò)程中，其顯著性按大小依次排列為葡萄糖質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)速、溫度、初始pH值與(NH4)2SO4質(zhì)量濃度，葡萄糖質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)速與溫度對(duì)抑制率影響顯著，可信度在90%以上，可作為主要影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。其他次要因素取值則根據(jù)效應(yīng)正負(fù)選定，正取較高值，負(fù)取較低值。由Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果確定葡萄糖質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)速有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增大，溫度具有顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Plackett-Burman design with experimental results

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)因素效應(yīng)分析結(jié)果Table 2 Signifi cance test of factors involved in Plackett-Burman design

表3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of steepest ascent experiments

由表3可知，最優(yōu)發(fā)酵條件可能在試驗(yàn)3與試驗(yàn)4之間，且試驗(yàn)4更接近最優(yōu)條件，故以試驗(yàn)4為中心點(diǎn)進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)條件

根據(jù)上述結(jié)果釆用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，包括12 個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和3 個(gè)中心試驗(yàn)。以x1葡萄糖質(zhì)量濃度/（g/L）、x2溫度/℃、x3轉(zhuǎn)速/（r/min）為自變量，經(jīng)過(guò)編碼轉(zhuǎn)換可得：X1=（x1－46）/5，X2=（x2－28）/4，X3=（x3－195）/15。三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

利用統(tǒng)計(jì)軟件MINTAB 15對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合。建立二次響應(yīng)面回歸模型，尋求最優(yōu)相應(yīng)因子水平，所得的分析結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，利用MINITAB擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到α-葡萄糖苷酶抑制率對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度、溫度、轉(zhuǎn)速的三元二次回歸方程：Y= 0.357 1+0.015 3X1－0.020 0X2+0.007 6X3－0.022 7X12－0.045 4X22－0.024 8X32－0.026 3X1X2－0.001 5X1X3－0.013 7X2X3。X1、X2、X3分別為葡萄糖質(zhì)量濃度、溫度和轉(zhuǎn)速的編碼水平?；貧w分析顯著性檢驗(yàn)表明，方程的F值＞F0.01（9,5），該模型失擬不顯著。為了求得最佳培養(yǎng)條件，用所得的回歸方程分別對(duì)各自變量求一階偏導(dǎo)數(shù)。并分別令得三元一次方程組，并解出X1=0.409 7、X2=－0.146 2、X3= 0.362 4，即當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為48.05 g/L、溫度為27.42 ℃、轉(zhuǎn)速為200.44 r/min時(shí)，發(fā)酵液的理論α-葡萄糖苷酶抑制率為39%。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果回歸分析Table 5 Regression analysis of the experimental results from Box-Behnken design

根據(jù)三元二次回歸方程，利用MINITAB繪出響應(yīng)面分析圖及其等高線，如圖2～4所示。

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度和溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 Surface and contour plots for the effects of glucose concentration and temperature on inhibitory rate against α-glucosidase

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度和轉(zhuǎn)速對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.3 Surface and contour plots fore the effects of glucose concentration and rotation speed on inhibitory rate against α-glucosidase

圖4 溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 Surface and contour plots for the effects of temperature and rotation speed on inhibitory rate against α-glucosidase

每個(gè)響應(yīng)曲面或等高線圖代表著兩個(gè)獨(dú)立變量間的相互作用，可以非常直觀地看到因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的變化趨勢(shì)。葡萄糖質(zhì)量濃度與轉(zhuǎn)速的等高線近似正圓形，這說(shuō)明它們間的交互作用是不顯著的。而葡萄糖質(zhì)量濃度與溫度、溫度與轉(zhuǎn)速的等高線則呈橢圓形，說(shuō)明因素之間交互作用顯著。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用響應(yīng)面優(yōu)化過(guò)的最優(yōu)條件（為方便操作，取葡萄糖質(zhì)量濃度為48.05 g/L、溫度為27.4 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得α-葡萄糖苷酶抑制率為38.52%。驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)真實(shí)值的吻合度高，說(shuō)明該模型可以很好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3 討 論

α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的一類藥物。α-葡萄糖苷酶抑制劑的成分多樣，如白背三七中的多糖、虎杖中的糖類和鞣質(zhì)、杜仲中的槲皮素、知母中的皂苷等[17-20]。α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法也有多種，從微生物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑在近年來(lái)已成為比較活躍的領(lǐng)域之一。阿卡波糖是直接從游動(dòng)放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中提取、分離得到的[21]，伏格列波糖和米格列醇則是分別對(duì)放線菌和芽孢桿菌的次級(jí)代謝活性產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而得到[22-23]。郎國(guó)竣[12]從土壤中篩選出可抑制α-葡萄糖苷酶活性的微生物。該菌株為鏈霉菌屬，與小白鏈霉菌16S rDNA序列同源性達(dá)到98%以上。楊明琰等[24]也從土壤中篩選出一株對(duì)豬胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶同時(shí)具有強(qiáng)烈抑制作用的菌株D0406，其每毫升發(fā)酵液的抑制活性約相當(dāng)于0.6 mg阿卡波糖的抑制活性，鑒定結(jié)果表明菌株D0406為鏈霉菌屬。倪孟祥等[25]從海洋微生物中分離出α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌6 株。其中菌株N-1的代謝產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強(qiáng)，每毫升N-1樣品液中含有的活性代謝產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用相當(dāng)于5 mg的阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。本研究利用從栗豆樹(shù)種子中篩選得到的植物內(nèi)生菌B. cereus SD6進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件后，300 μL發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為38.52%，是未優(yōu)化前α-葡萄糖苷酶抑制率（23.21%）的1.66倍，并且高于0.6 mg/mL阿卡波糖溶液對(duì)釀酒酵母α-葡萄糖苷酶的抑制率（25.70%）[11]。

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Optimization of Fermentation Conditions of Endophyte for Producing α-Glucosidase Inhibitor by Response Surface Methodology

XIE Haobo, PENG Shulin, MEN Siqi, MING Huihui, LIN Meizhen, WEI Ning, PENG Ren*
(College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

The fermentation conditions for producing α-glucosidase inhibitor by an endophyte named Bacillus cereus SD6 were optimized using response surface methodology in the present study. The results of Plackett-Burman experiments showed that glucose concentration, rotation speed and temperature had signifi cant effects on the inhibition of α-glucosidase by fermentation liquid, with more than 90% confi dence. Bex-Behnken experiments were applied for the optimization of the fermentation conditions through response surface analysis. The optimal conditions for glucose concentration, rotation speed and fermentation temperature were determined as 48.05 g/L, 200.44 r/min and 27.42 ℃, respectively. Under these fermentation conditions, the maximum predicted inhibitory rate of the fermentation liquid against α-glucosidase was 39%, agreeing with the experimental value of 38.52%. The good consistency indicated the feasibility of the developed prediction model.

response surface methodology; α-glucosidase inhibitors; endophyte

TQ92

A

1002-6630（2015）19-0217-05

10.7506/spkx1002-6630-201519039

2015-04-14

謝皓波（1994-），男，本科生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。E-mail：740834602@qq.com

*通信作者：彭仁（1972-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。E-mail：renpeng@jxnu.edu.cn