王新繪，劉曉穎，李 冠,*

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌的分離鑒定及16S rDNA序列分析

王新繪1，劉曉穎2，李 冠1,*

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

從新疆昌吉甜瓜實(shí)驗(yàn)田中采集發(fā)病甜瓜樣品12 份，對(duì)甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌進(jìn)行分離純化，并根據(jù)形態(tài)觀察、致病性測(cè)定得到甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌1 株。以該菌總DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，并克隆到pGM-T載體，測(cè)序結(jié)果表明：克隆的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 493 bp，通過(guò)GenBank上序列比對(duì)搜索工具分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明該菌屬于Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems（Aac），即燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N。

甜瓜；細(xì)菌性果斑??；燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N；鑒定

瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病是危害西瓜、甜瓜等葫蘆科植物的一種毀滅性病害，也是世界各國(guó)公認(rèn)的檢疫性病害。該病主要引起西瓜、甜瓜、籽瓜果實(shí)的腐爛，導(dǎo)致減產(chǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。在高濕高溫條件下，細(xì)菌性果斑病具有發(fā)病快、防治難、危害重等特點(diǎn)[1]。該病最早于1969年在美國(guó)佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)[2]。1978年Schaad等[3]將其病原菌鑒定為類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種。1992年Willems等[4]根據(jù)rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交的結(jié)果，將該病原菌更名為燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac）。近年來(lái)，我國(guó)新疆、寧夏、內(nèi)蒙古、海南等地都有瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病的發(fā)生[5-7]，田間發(fā)生瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病主要是由于病原菌通過(guò)傷口和氣孔侵染寄主[8]。病害遠(yuǎn)距離傳播是通過(guò)種子帶菌進(jìn)行傳播[9-12]，對(duì)瓜類(lèi)作物的生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

新疆作為甜瓜的主產(chǎn)區(qū)，由于近年來(lái)細(xì)菌性果斑病的發(fā)生，瓜農(nóng)種植的積極性受到嚴(yán)重影響，特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)萎縮。趙延昌等[5]最早對(duì)新疆甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為引起甜瓜細(xì)菌性果斑病發(fā)生的病原是燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（Aac），屬革蘭氏陰性菌，菌體短桿狀，屬rRNA組I，他們主要是依據(jù)細(xì)胞的表型特征及生理生化性質(zhì)等傳統(tǒng)方法進(jìn)行病原菌鑒定。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開(kāi)始在分子水平對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定。16S rDNA是研究細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系的重要指標(biāo)[13]。16S rDNA序列的比較分析已經(jīng)成為鑒定細(xì)菌種屬和分類(lèi)的重要方法之一，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)研究[14-17]。本研究利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物對(duì)實(shí)驗(yàn)田中發(fā)病甜瓜中采集的菌株進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。將獲得的序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)和同源分析，用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用發(fā)病甜瓜為新疆厚皮甜瓜“皇后”，采集于新疆昌吉國(guó)家瓜類(lèi)工程研究中心實(shí)驗(yàn)田，病狀為發(fā)病中期，即瓜體表皮出現(xiàn)褐色凹陷病斑。

T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、pGM-T克隆試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；EZ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 北京全式金生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為KB培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、甘油10.0 g、磷酸氫二鉀1.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、瓊脂17.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000 PCR儀、凝膠成像分析儀及Quantity One 4.5.0成像軟件 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

參照方中達(dá)[18]的方法，取發(fā)病的甜瓜，用70%酒精進(jìn)行表面消毒，然后放入無(wú)菌操作臺(tái)，將病瓜縱向切開(kāi)，切取瓜內(nèi)部病健交界組織，75%酒精消毒2 min，放入滅菌水中連續(xù)漂洗3 次，放入滅菌研缽研碎，加無(wú)菌水浸泡20～30 min，然后用滅菌的接種環(huán)蘸取該組織液在KB培養(yǎng)基表面上劃線，28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，1～2 d后觀察待分離菌生長(zhǎng)情況。

用滅菌環(huán)挑取單菌落，再用平板劃線法純化3 次，28 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落時(shí)即為純菌種，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察

在菌株生長(zhǎng)平板上觀察菌落的形態(tài)。再經(jīng)過(guò)革蘭氏染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

1.3.3 菌株致病性測(cè)定

參照方中達(dá)[18]的方法，將分離純化的菌株在KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，然后將菌株配成3×108個(gè)/mL的菌懸液。無(wú)菌栽培“皇后”品種甜瓜，在苗齡為4～6 葉期時(shí)將菌懸液噴霧接種到葉片上，以無(wú)菌水噴霧作對(duì)照，套袋保濕48 h，鑒定溫度在25～30 ℃之間，噴霧接種后的第15天觀察記錄發(fā)病情況。每菌株接種4缽，重復(fù)3次。

1.3.4 菌株DNA提取及16S rDNA擴(kuò)增

病菌的總DNA提取使用EZ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作。16S rDNA擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R （5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 模板約2.0 μL、10×PCR緩沖液5.0 μL、10 mmol/L的P1和P2各0.5 μL、dNTP （10 mmol/L）4 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，加滅菌雙蒸水至50.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2～3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)。

1.3.5 PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收的PCR產(chǎn)物，與pGM-T克隆載體連接（連接體系10 μL：PCR產(chǎn)物4 μL、T4 DNA連接酶1 μL、Buffer 1 μL、載體1 μL、雙蒸水3 μL），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行重組克隆的篩選與酶切鑒定。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)及《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[19]的常規(guī)方法進(jìn)行。選取陽(yáng)性的重組子，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序工作由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3.6 16S rDNA測(cè)序結(jié)果分析

測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）同源性比對(duì)分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），獲得相似性高的序列，用MEGA5.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化結(jié)果

圖1 分離純化菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strains

將所采病樣12 份經(jīng)過(guò)3 次單菌落的分離和純化，通過(guò)菌落特征和顯微細(xì)胞形態(tài)觀察，分離統(tǒng)計(jì)結(jié)果，共得到細(xì)菌3 株，編號(hào)為xjgb-wy2、xjgb-wy3、xjgb-wy6。菌株在KB培養(yǎng)基上形成的菌落較多，且菌落形態(tài)單一。菌落呈現(xiàn)乳白色、圓形、全緣、隆起、光滑、不透明，對(duì)光觀察周?chē)型该魅Γ▓D1）。革蘭氏染色陰性。菌株的形態(tài)特征與已報(bào)道的甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌形態(tài)特征較一致[5]。

2.2 菌株致病性測(cè)定結(jié)果

將分離純化得到的3 個(gè)菌株接種到甜瓜葉片后，5～6 d后觀察只有菌株xjgb-wy6接種的甜瓜葉片開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀。第15天觀察發(fā)病癥狀，發(fā)現(xiàn)甜瓜葉部病斑表現(xiàn)為從葉緣開(kāi)始沿葉脈向內(nèi)擴(kuò)展的黃褐色病斑，為圓形或多角形，后期中間變薄易開(kāi)裂，褐色焦枯，嚴(yán)重時(shí)連片，可以脫離穿孔（圖2），與田間甜瓜細(xì)菌性果斑病發(fā)病癥狀一致。取病斑的病健交界處又分離到了此病原細(xì)菌。上述結(jié)果表明菌株xjgb-wy6對(duì)甜瓜具有致病性。

圖2 分離純化菌株的致病性Fig.2 Pathogenicity assay of isolated strains

2.3 病原菌DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

收集活化的病原菌xjgb-wy6，培養(yǎng)菌株至OD600 nm達(dá)到0.6～0.8后利用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示病原菌xjgb-wy6總DNA條帶清晰、無(wú)彌散帶，雜質(zhì)較少，可以用于后續(xù)PCR擴(kuò)增（圖3）。

圖3 病原菌xjgb-wy6基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of total DNA of pathogenic strain xjgb-wy6

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplifi cation products

如圖4所示，以提取的病原菌總DNA為模板，使用16SrDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致，在1500bp左右。

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，連接于pGM-T載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5α中，提取質(zhì)粒，電泳鑒定，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（EcoRI和PstI）鑒定，結(jié)果如圖5所示，獲得了PCR產(chǎn)物和連接載體的條帶，其中PCR產(chǎn)物被EcoRI切為了2 條條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了PCR產(chǎn)物與pGM-T載體連接成功，送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

圖5 PCR連接產(chǎn)物的雙酶切結(jié)果Fig.5 Double restriction enzyme digestion of pGM-T-16S rDNA

2.5 16S rDNA測(cè)序結(jié)果及分析

圖6 基于菌株xjgb-wy6的16S rDNA序列和Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of xjgb-wy6 and Neighbor-Jioning analysis

將克隆的病原菌（xjgb-wy6）16S rDNA片段測(cè)序，結(jié)果表明該菌株16S rDNA由1 493 個(gè)核苷酸組成，測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank，登錄號(hào)為KP862624。將該序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與Acidovorax cattleyae、Acidovorax citrulli及Acidovorax avenae的一些致病變種的相似性為99%。用MEGA5.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖6），從進(jìn)化樹(shù)中可看出與xjgb-wy6菌株進(jìn)化關(guān)系最為接近的細(xì)菌是Acidovorax citrulli，其次是Acidovorax cattleyae，這些菌均屬于燕麥?zhǔn)人峋鷮伲ˋcidovorax），這與BLAST比對(duì)結(jié)果一致。

3 討 論

甜瓜細(xì)菌性果斑病菌對(duì)幼苗和果實(shí)均能侵染，構(gòu)成了其病害循環(huán)的一部分[20]，病菌可以由果實(shí)的氣孔或傷口感染，發(fā)病初期病斑只局限在果皮，發(fā)病中后期，病菌可以蔓延至果肉，引起全果腐爛。本實(shí)驗(yàn)中分離菌采用的部位為發(fā)病中期的果實(shí)，回接菌的部位為幼苗。根據(jù)上述致病性測(cè)定結(jié)果，將從果實(shí)中分離純化的菌株xjgb-wy2、xjgb-wy3和xjgb-wy6接種甜瓜葉片后，只有xjgb-wy6產(chǎn)生發(fā)病癥狀，且癥狀與田間果實(shí)自然發(fā)病癥狀相同，與文獻(xiàn)報(bào)道的癥狀也一致[21]。接種后從葉片產(chǎn)生的病斑中又分離到了此病原菌，表明菌株xjgb-wy6對(duì)甜瓜具有致病性，同時(shí)依據(jù)形態(tài)學(xué)特征分析，確定該菌是甜瓜細(xì)菌性果斑病的病原菌。

將菌株xjgb-wy6的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果顯示其與Acidovorax cattleyae、Acidovorax citrulli及Acidovorax avenae的一些致病變種的相似性為99%。同時(shí)用MEGA5.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[22-23]，結(jié)果顯示與該菌株進(jìn)化關(guān)系最為接近的細(xì)菌是Acidovorax citrulli。綜上所述，可以確定菌株xjgb-wy6屬于Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems，即燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N。此結(jié)果也與趙廷昌等[5]報(bào)道的在哈密瓜上得到的鑒定結(jié)果相同。對(duì)不同細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析是推斷細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化關(guān)系的重要方法，本研究對(duì)甜瓜細(xì)菌性果斑病菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析，建立了其在細(xì)菌系統(tǒng)演化樹(shù)上的分類(lèi)地位，明確了不同菌種之間的同源程度，從而確定了它們之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化地位。

甜瓜細(xì)菌性果斑病在我國(guó)發(fā)生較為普遍，一些甜瓜種植區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。我國(guó)從1987年開(kāi)始有該病的報(bào)道，新疆作為甜瓜的主產(chǎn)區(qū)，雨水較多的年份細(xì)菌性果斑病發(fā)生較為嚴(yán)重。目前針對(duì)甜瓜細(xì)菌性果斑病的研究主要集中在病原菌檢測(cè)、生理生化特性及致病性等方面[24-28]。為進(jìn)一步明確新疆甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌的分類(lèi)地位，本研究分離純化了病原菌并對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定，利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定和分析，為從分子水平進(jìn)行甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌鑒定和分類(lèi)提供了依據(jù)。

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Isolation, Identifi cation and 16S rDNA Sequence Analysis of Bacterial Fruit Blotch Pathogen in Melon

WANG Xinhui1, LIU Xiaoying2, LI Guan1,*
(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 2. College of Resource and Environment Sciences, Xinjiang University, ürümqi 830046, China)

Twelve fruits of melon with bacterial fruit blotch collected from Changji, Xinjiang were investigated for the isolation and purifi cation of the pathogen. The pathogenic strain was subjected to polymerase chain reaction (PCR) amplifi cation with the bacterial 16S rDNA universal primer using its total DNA as the template and the products were cloned into pGM-T vector. Sequencing analysis revealed that the fragment had a length of 1 493 bp. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) and phylogenetic tree analysis showed that the strain belongs to Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems (Aac).

melon; bacterial fruit blotch; Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems; identifi cation

Q945.8

A

1002-6630（2015）19-0186-04

10.7506/spkx1002-6630-201519033

2015-04-01

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011211B09）

王新繪（1979-），男，博士研究生，研究方向?yàn)橘Y源植物學(xué)。E-mail：wangxh@xju.edu.cn

*通信作者：李冠（1949-），男，教授，碩士， 研究方向?yàn)橹参锷砩c分子生物學(xué)。E-mail：guanli@xju.edu.cn