崔 潔，李 琳，張喬會，董施斌，王建中,*

（1.北京林業(yè)大學(xué)自然保護區(qū)學(xué)院，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083）

功能山杏整仁的酶法制備條件優(yōu)化及功能評價

崔 潔1，李 琳2，張喬會2，董施斌2，王建中2,*

（1.北京林業(yè)大學(xué)自然保護區(qū)學(xué)院，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083）

本研究對完整形態(tài)的山杏整仁進行酶解，使之釋放出具有功能活性的短肽，以強化或賦予其保健功能，擬開發(fā)出具有降血糖和抗氧化活性的功能山杏仁產(chǎn)品。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化脫苦山杏整仁的酶解條件，得到的最佳酶解參數(shù)為：溫度50 ℃、pH 7.0、加酶量6.0%、酶解時間8.0 h；同等條件下進行驗證實驗，得到山杏整仁的水解度為26.43%，與理論模型預(yù)測值27.85%基本相符。脫苦山杏整仁水解物表現(xiàn)出了良好的體外抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性。當質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基（O2－·）和羥自由基（·OH）的清除率分別為50.44%、65.22%、22.78%；當質(zhì)量濃度為160.00 mg/mL時，其總還原力（吸光度）為1.072；通過超濾分離得到≤5、5～10、10～30、≥30 kD這4 組不同分子質(zhì)量組分，當質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為3.65%、4.43%、7.94%、10.00%；選取抑制效果最好的≤5 kD組分經(jīng)凝膠層析進一步分離得到3 個洗脫峰，質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，3 個洗脫峰的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為11.52%、10.65%、9.67%。結(jié)果表明：脫苦山杏整仁酶解后產(chǎn)生了具有良好抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性的多肽，與未經(jīng)酶解的山杏整仁相比，其保健活性顯著提高。

山杏整仁；功能食品；木瓜蛋白酶；響應(yīng)面；抗氧化；α-葡萄糖苷酶抑制活性

山杏（Armeniaca sibirica）是薔薇科杏屬植物，又稱西伯利亞杏，其杏仁可食，種皮深黃色或紅棕色，略扁呈心形，種子長1～1.5 cm，寬約1 cm[1]。山杏蛋白的氨基酸組成豐富，含有8 種人體所必需的氨基酸，含量為7.92%，占到山杏蛋白氨基酸總量的30%左右，比其他堅果類食品氨基酸種類多、含量比例好，是良好的蛋白來源[2]。目前山杏蛋白的應(yīng)用研究主要是制備功能多肽，或制成藥劑形式的功能性產(chǎn)品或直接作為食品輔料加入食品中[3-4]。但因深加工水平落后使得我國杏仁主要以原料形式出口，2009年我國山杏整仁產(chǎn)量約2×104t，出口量7 000～8 000 t，占世界貿(mào)易量的80%[5]。隨著杏仁產(chǎn)量不斷提高，需要探索杏仁油脂特別是杏仁蛋白質(zhì)的高值化、功能化開發(fā)手段，以杜絕不必要的資源浪費[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，山杏整仁蛋白經(jīng)酶消化后會釋放出具有生物學(xué)功能的肽類，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)激素分泌、調(diào)節(jié)生理代謝、促進礦質(zhì)吸收、增進免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗氧化等特性[7]。

以食品自身為載體，強化或賦予其一定的功能活性是當今功能食品的研究發(fā)展方向之一。本研究以脫苦山杏整仁為原料，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解山杏整仁（富肽功能山杏整仁），以期強化或賦予山杏整仁營養(yǎng)功能。首先以水解度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面方法優(yōu)化山杏整仁酶解工藝參數(shù)，探索富含功能多肽的山杏整仁保健產(chǎn)品的加工技術(shù)；其次，評價山杏整仁酶解物的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究旨在為富含功能性多肽的山杏整仁保健產(chǎn)品的研發(fā)提供新思路，并為其合理應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山杏整仁，由承德平泉亞歐杏仁貿(mào)易有限公司提供。

α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（純度＞99 %）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2CO3、無水乙醇、木瓜蛋白酶（4.342×104U/g）、中性甲醛、石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸 北京化工廠；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三氯乙酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、雙氧水、鐵氰化鉀、氯化鐵 天津市津科精細化工研究所。以上試劑除特別說明外均為分析純。實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；TH/T16MM臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、752 紫外分光光度計上海美譜達儀器有限公司；PHS-3D型精密型pH計 上海三信儀表廠；真空冷凍干燥機LL-1500 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SENCOR-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；Model-680酶標儀 美國Bio-Rad公司；高效液相色譜分析儀 上海滬西儀器分析廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

山杏整仁含水量檢測參考GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分測定》；吸水率檢驗參考SN/T 0800.10-1999《進出口糧食、飼料吸水率檢驗方法》；水解度的測定方法參考文獻[8-9]。

1.3.2 山杏整仁的酶解工藝流程及操作要點

酶解工藝流程：山杏整仁→脫苦→去皮→浸酶→培養(yǎng)→滅酶→烘干。

操作要點：將脫苦去皮的山杏整仁浸泡到按一定比例配制好的酶液中，55 ℃、一定酸堿度條件下充分浸漬4.0 h，將浸足酶液的山杏整仁取出密封，在一定溫度條件下使用木瓜蛋白酶酶解，酶解好的山杏整仁于100 ℃滅酶10 min，在干燥箱中烘干，封袋保藏。脫苦方法[10]：脫苦時間20 min，液料比為10∶1（V/m），檸檬酸質(zhì)量濃度為0.24 g/L，脫苦溫度為82℃，真空度為－0.09 MPa。

1.3.3 山杏整仁酶解條件單因素試驗

首先，固定酶解pH值為7.0、酶解時間為7.0 h、酶解溫度為50 ℃，分別以加酶量（質(zhì)量分數(shù)，下同）為4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%進行酶解；其次，固定酶解pH值和酶解溫度同上，加酶量為6.0%，分別酶解3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 h；再次，分別在pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下進行酶解，固定其他因素同上；最后，分別以45、50、55、60、65℃環(huán)境進行酶解，固定其他因素同上。所有試驗重復(fù)3 次，以水解度為指標確定最佳因素水平。

1.3.4 山杏整仁酶解條件響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取影響酶解效果顯著的3 個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，運用Design Expert 7.1軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理[11-14]，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以山杏整仁水解度為響應(yīng)值，確定最佳制備工藝。

1.3.5 山杏整仁酶解多肽的制備

根據(jù)1.3.4節(jié)得到的最佳酶解工藝制備山杏整仁，經(jīng)粉碎磨粉過篩，取山杏整仁粉在50 ℃去離子水中恒溫攪拌浸提1.0 h，冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥，備用。

1.3.6 山杏整仁酶解液的體外抗氧化能力測定

以未酶解的山杏整仁作為參照，測定山杏整仁酶解后抗氧化能力變化。其中， DPPH自由基清除率測定方法參照文獻[15-16]；超氧陰離子自由基清除率測定方法參照文獻[17-18]；羥自由基（·OH）清除率測定方法參照文獻[19]；還原力測定方法參照文獻[20]。

1.3.7 山杏整仁酶解液中具有α-葡萄糖苷酶抑制劑活性（α-glucosidase inhibitor activity，AGA）組分的篩選分離

將山杏整仁酶解溶液微濾后，分別經(jīng)截留分子質(zhì)量為5、10、30 kD的超濾膜進行超濾，進行體外α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測，然后經(jīng)凝膠層析分離，再測定其α-葡萄糖苷酶抑制活性。

層析條件：樣品質(zhì)量濃度：50 mg/mL；進樣量2.0 mL；流速1.50 mL/min；洗脫液Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）；凝膠柱規(guī)格：1.5 cm×60 cm，填料為G-25葡聚糖凝膠，檢測波長為280 nm[21]。

α-葡萄糖苷酶抑制率測定方法參照文獻[22]，有所調(diào)整。計算公式如下：

式中：A樣品為樣品體系在405 nm波長處的吸光度；A空白為空白體系在405 nm波長處的吸光度；A背景為不加酶體系在405 nm波長處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗均重復(fù)3 次，取平均值，采用t檢驗進行的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山杏整仁的含水量和吸水率

按照GB 5009.3-2010方法測得脫苦山杏整仁的含水量為3.80%左右。根據(jù)基礎(chǔ)含水量，測定在50 ℃條件下山杏整仁的吸水率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 山杏整仁吸水率變化Fig.1 Effect of hydrolysis time on water-absorbing capacity of apricot kernel

由圖1可知，山杏整仁在前2 h內(nèi)吸水迅速，而后趨于平緩，在第4小時山杏整仁的吸水率達到53.34%，與第3小時差異顯著（P＜0.05），而第5小時后山杏整仁的吸水率有所減小，可能是山杏整仁中的可溶性物質(zhì)溶出所致，故確定山杏整仁酶解液浸漬時間為4.0 h。

2.2 單因素試驗結(jié)果

圖2 不同單因素對山杏整仁水解度的影響Fig.2 Effects of different factors on enzymatic hydrolysis of apricot kernel

由圖2a可知，在一定條件下，山杏整仁水解度隨木瓜蛋白酶加酶量的增加也平穩(wěn)增加，當加酶量在8%時，水解度達到28.03%，說明底物與酶解條件一定的情況下，山杏整仁水解度隨加酶量的遞增而增加。酶用量繼續(xù)增加，水解度變化幅度不大，可能是酶解液已達到飽和狀態(tài)。同時酶用量太大會影響山杏整仁的口感和色澤，導(dǎo)致其感官食用性降低；由圖2b可知，溫度在50℃時，山杏整仁水解度達到了最大值25.85% （P＜0.05），隨后溫度升高，水解度反而下降，這可能是溫度超過木瓜蛋白酶的最適溫度，導(dǎo)致酶活性下降，酶解效果降低；由圖2c可知，當pH＜7.0時，隨pH值升高，山杏整仁水解度提高，在pH 7.0時達到最大值25.76%（P＜0.05），而在pH＞7.0后山杏整仁水解度開始降低，這可能是超出木瓜蛋白酶最適pH值所致；由圖2d可知，當酶解時間＜8 h時，山杏整仁水解度隨酶解時間延長而增加，趨勢明顯；第8小時達到25.53%（P＜0.05），之后隨時間延長增加幅度減小，這可能是底物減少造成的。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面數(shù)據(jù)及模型的建立

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進行進一步優(yōu)化試驗，以酶解溫度、酶解pH值、加酶量3 個因素作為變量，以水解度Y為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗（表1）。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 1 Box-Behnken design with experimental values of hydrolysis degree

根據(jù)表1的試驗結(jié)果，經(jīng)回歸分析后得回歸方程：

表2 回歸方程方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equation

由表2可知，此回歸模型的F值為242.16，P＜0.001，表明該模型高度顯著，并由P值可知,只有＜0.1%的機率發(fā)生模擬無效，而失擬項不顯著，這說明該模型符合實際實驗情況，能夠很好地模擬該實驗的結(jié)果。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Signifi cance test of regression equation

由表3可知，各因素對水解度的影響均極顯著（P＜0.01）。由F值可知，各因素對山杏整仁水解度的影響次序是酶解pH值＞加酶量＞酶解溫度。

2.3.2 響應(yīng)面分析

利用Design Expert軟件根據(jù)響應(yīng)面模型的擬合結(jié)果，以山杏整仁水解度為響應(yīng)值，固定1 個因素于中心水平，以另外2個因素為自變量繪制響應(yīng)面和等高線，見圖3。由圖中可以直觀看出該響應(yīng)面模型具有最高點。

圖3 不同因素交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface and contou r plots for the effects of different factors on hydrolysis degree

根據(jù)上述模型擬合結(jié)果可知，山杏整仁的最優(yōu)酶解工藝是酶解溫度50 ℃、酶解pH 7.0、加酶量6.0%，在此條件下模型預(yù)測山杏整仁水解度最高為27.85%。為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測結(jié)果是否可靠，對上述條件進行了驗證，得到山杏整仁水解度為26.43%，與預(yù)測值基本一致，由此得出該模型可以很好地模擬預(yù)測山杏整仁的酶解條件。

2.4 山杏整仁酶解液的體外抗氧化活性

圖4 山杏整仁酶解液的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant activity of apricot kernel hydrolysate

由圖4a可知，未經(jīng)酶解的山杏整仁同樣具有一定的DPPH自由基清除能力，經(jīng)對比可看出，酶解山杏整仁清除DPPH自由基的能力更強，且清除率與劑量相關(guān)，說明酶解產(chǎn)生了更多清除DPPH自由基的小分子肽類。當酶解山杏整仁質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到了最大值50.44%（P＜0.05）；由圖4b可知，酶解后山杏整仁清除O2－·能力也明顯提升，且清除能力隨質(zhì)量濃度增加而增強。當酶解山杏整仁質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，清除率達到65.22%（P＜0.05）。而后O2－·清除效果逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)，這說明山杏整仁經(jīng)酶解后多肽含量增多，逐步達到其最大清除能力；山杏整仁經(jīng)酶解清除·OH能力亦明顯提高，且隨質(zhì)量濃度升高穩(wěn)定上升，當酶解山杏整仁質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，·OH清除率達到22.78%（P＜0.05），說明酶解后山杏整仁具有更好的清除·OH能力；山杏整仁較酶解前還原力大幅提升且與樣品質(zhì)量濃度成正相關(guān)，當質(zhì)量濃度為160.00 mg/mL時，在700 nm波長處的吸光度達到1.072 （P＜0.05），這說明酶解使得山杏整仁具有更好的還原力。這些結(jié)果與先磨粉后酶解的山杏整仁多肽抗氧化能力結(jié)果非常接近[2]，同時與其他蛋白酶解產(chǎn)物相比較[23]，抗氧化能力更有優(yōu)勢，這也充分印證了酶解山杏整仁富含多肽的營養(yǎng)價值。

2.5 山杏整仁酶解液AGA測定結(jié)果

2.5.1 超濾組分AGA測定結(jié)果

圖5 不同分子質(zhì)量山杏整仁多肽α-葡萄糖苷酶抑制率曲線Fig.5 Inhibition curves of apricot kernel peptides with different molecular weights against α-glucosidase

由圖5可知，隨質(zhì)量濃度增加，不同分子質(zhì)量超濾組分的α-葡萄糖苷酶抑制率都相應(yīng)增加；當質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，≤5、5～10、10～30、≥30 kD組分對α-葡萄糖苷酶的抑制率可分別達10.00%、7.94%、4.43%、3.65%。說明分子質(zhì)量越小，α-葡萄糖苷酶抑制效果越好。這與王晟等[24]對山杏整仁先磨粉后酶解的結(jié)果相比，抑制效果接近但是稍弱一些，原因可能是山杏整仁與酶解液接觸不充分，酶解效果較后者弱一些；與蜂王漿水溶性蛋白多肽的抑制效果趨勢一致[25]，分子質(zhì)量越小，抑制效果越好。

2.5.2 山杏整仁酶解液中≤5 kD組分凝膠層析結(jié)果與AGA分析

圖6 6 ≤5 kD活性組分的Sephadex G-25分離譜圖（a）及分離組分的AGA比較結(jié)果（b）bFig.6 Separation of ≤ 5 kD peptides isolated from pepsin hydrolysate using Sephadex G-25 and their inhibitory effect curves

由圖6可知，山杏整仁酶解液中≤5 kD組分經(jīng)凝膠層析分離得到3 個洗脫峰，當質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時，3 個洗脫峰的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為11.52%、10.65%、9.67%，洗脫峰1中多肽活性較高。與分離前抑制效果區(qū)別不大，這一點與蜂王漿水溶性蛋白多肽不同[25]，后者分子質(zhì)量變小之后，尤其是＜650 D的分子質(zhì)量片段，抑制效果可以達到35%。

3 結(jié) 論

本實驗測得脫苦山杏整仁含水量為3.80%，且第4小時吸水率基本接近最大值，為53.34%，故后期山杏整仁在酶液中浸泡時間定為4.0 h。

通過響應(yīng)面方法優(yōu)化了山杏整仁最佳酶解條件為：酶解溫度50℃、酶解pH 7.0、加酶量6.0%。并在此條件下進行驗證實驗，水解度為26.43%，與預(yù)測值27.85%相接近，說明該響應(yīng)面模型可以很好地模擬預(yù)測山杏整仁酶解條件。而且，本實驗制備酶解山杏整仁的方法工藝簡單、技術(shù)成熟、易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

本實驗測得山杏整仁經(jīng)酶解后具有更好的抗氧化活性和一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，其中酶解物中≤5 kD組分在經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析前后α-葡萄糖苷酶抑制活性變化不大，表明酶解后富含多肽的山杏整仁的抗氧化應(yīng)激損傷和抑制餐后血糖上升的能力明顯增強，同時也說明無需進行功能活性部位的分離提純，這將大大降低加工成本。因此，通過整仁酶解方法提升山杏整仁的功能保健性與食用性是可行的。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Whole Apricot (Armeniaca sibirica) Kernel and Biological Activities of Its Hydrolysate

CUI Jie1, LI Lin2, ZHANG Qiaohui2, DONG Shibin2, WANG Jianzhong2,*
(1. School of Nature Conservation, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety, College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

By using single factor and orthogonal array designs, the optimized hydrolysis conditions of whole apricot kernel employing papain for improved degree of hydrolysis were obtained as hydrolysis temperature of 50 ℃, initial pH of 7.0, hydrolysis time of 8.0 h, and enzyme concentration of 6.0%. Under these conditions, the maximum experimental value of hydrolysis degree of 26.43% was achieved, agreeing with the predicted value of 27.85%. This paper also reports on the antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory effect of the enzymatic hydrolysate. The scavenging rates of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH), superoxide anion radicaland hydroxyl radical (·OH) with the hydrolysate at a concentration of 10.00 mg/mL were 50.44%, 65.22% and 22.78%, respectively. When the concentration increased to 160.00 mg/mL, the absorbance value for reducing power was 1.072. Four peptides extracted from the hydrolysate were separated by ultrafiltration as ≤ 5, 5-10, 10-30 and ≥ 30 kD. The inhibitory rates of α-glucosidase by the four peptides at 10.00 mg/mL were 3.65%, 4.43%, 7.94% and 10.00%, respectively. Then, the peptide fraction with molecular weight less than 5 kD, the most active against α-glucosidase, was further separated into three components by gel filtration chromatography, with inhibitory rates on α-glucosidase of 11.52%, 10.65% and 9.67%, respectively. The results showed that the peptides derived from enzymatic hydrolysate of whole apricot kernel have good antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory effect in vitro, exert ing improved health-protective effects than native apricot kernel.

whole apricot kernel; functional food; papain; response surface methodology; antioxidant activity; α-glucosidase inhibitory activity

TS201.2

A

1002-6630（2015）19-0153-06

10.7506/spkx1002-6630-201519027

2014-12-18

國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004081）

崔潔（1986-），女，博士，研究方向為植物資源利用與天然產(chǎn)物開發(fā)。E-mail：cuijie@bjfu.edu.cn

*通信作者：王建中（1952-），男，教授，碩士，研究方向為植物資源利用與天然產(chǎn)物開發(fā)，農(nóng)副產(chǎn)品加工與貯藏保鮮，區(qū)域農(nóng)業(yè)規(guī)劃。E-mail：w62338221@163.com