勾長龍,王雨瓊,2,孫 朋,畢彥暉,婁玉杰,2,高云航,*
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,吉林 長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室,吉林 長春 130118)
人參根腐病拮抗菌的篩選、鑒定及其抑菌活性
勾長龍1,王雨瓊1,2,孫 朋1,畢彥暉1,婁玉杰1,2,高云航1,*
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,吉林 長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室,吉林 長春 130118)
目的:從人參根際土壤中篩選出拮抗人參根腐病的菌株,初步研究其抑菌作用。方法:采用平板稀釋法從人參根際土壤中分離獲得菌株,以人參根腐病菌為靶標菌采用平板對峙法篩選出拮抗菌;通過形態(tài)學特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對篩選出的拮抗菌進行鑒定;檢測拮抗菌無菌發(fā)酵液對根腐病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的影響,同時測定拮抗菌的抑菌譜。結果:分離獲得一株對人參根腐病原菌拮抗作用較強的菌株HB-3,經(jīng)鑒定菌株HB-3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有顯著抑制作用;菌株HB-3的抑菌譜較廣,對根腐病菌、疫霉病菌、銹腐病菌、菌核病菌、灰霉病菌均有一定的抑菌活性。結論:篩選得到一株解淀粉芽孢桿菌HB-3,能顯著抑制人參根腐病菌的生長,對人參根腐病有較強的生物防治效果。
根腐病菌;解淀粉芽孢桿菌;無菌發(fā)酵液;拮抗譜
人參(Panax ginseng C. A. Mey)系五加科人參屬植物人參的干燥根,是一種名貴的中藥材[1]。由于其具有抗氧化、抗衰老、增強機體免疫力等多種藥理功效,又被譽為“百草之王”[2]。我國的吉林省是人參的主產(chǎn)區(qū),人參的出口量占世界總量的60%,在世界人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展中占有絕對的核心地位[3],然而人參病害的不斷發(fā)生嚴重地限制了吉林人參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計,我國人參病害有30余種,其中最常見且危害最嚴重的真菌性病毒害包括人參立枯病、人參黑斑病、人參疫病和人參根腐病。人參根腐病主要侵染人參的根部和葉片,造成根部軟化腐爛、葉片褪綠變黃,萎蔫死亡[4]。人參根腐病致使人參大面積減產(chǎn)、質(zhì)量大幅度下降,造成了巨大的經(jīng)濟損失。
目前控制人參根腐病的主要方法仍以化學殺菌劑為主,但由于化學殺菌劑容易出現(xiàn)抗藥性和藥物殘留,不僅污染環(huán)境,還嚴重地威脅人體健康。隨著人們對無公害食品的需求的日益增加以及對環(huán)境保護的日益關注,生物防治成為了人們控制植物病害的理想途徑[5-6]。因此,篩選出生物活性高、抗菌譜廣的菌株具有重要的意義。目前國內(nèi)外對番茄[7]、大蒜[8]、黃瓜[9]等植物生物防治的研究已經(jīng)取得了較大的進展,但對人參病毒害的生物防治還罕有報道。本研究從人參的根際土壤中篩選出一株對人參根腐病病原菌有極強拮抗作用的菌株HB-3,對其進行生理生化、16S rDNA序列鑒定,并對其防治效果進行了初步探討,以期為開發(fā)出具有應用價值的生防菌劑奠定基礎。
1.1 材料
1.1.1 供試土樣
供試土樣采自吉林長白縣、靖宇縣和四??h多年輪作無病害的人參土壤,以及人參根系部的土壤。
1.1.2 培養(yǎng)基
NA培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 15.0 g、瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2,121 ℃高壓滅菌20 min。
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值自然,121 ℃高壓滅菌20 min。
1.1.3 供試菌株
人參根腐病菌(Fusarium solani)、人參疫病菌(Phytophthora cactorum)、人參灰霉病菌(Botrytis cinerea)、人參銹腐病菌(Cylindrocarpon destructans)、人參菌核病菌(Sclerotinia schinseng),均由吉林農(nóng)業(yè)大學動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室保存。
1.2 方法
1.2.1 拮抗菌的分離純化
稱取10 g樣品轉(zhuǎn)移至盛有90 mL無菌水的錐形瓶中,搖床振蕩2 h后靜置1 h。取上清液稀釋為10-1~10-77 個稀釋度,分別涂布于PDA和NA培養(yǎng)基上。在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3~7 d,在NA培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)1~4 d,根據(jù)菌落的形態(tài)特征挑取單菌落進行純化培養(yǎng)并保存菌種。
1.2.2 拮抗菌篩選
采用平板對峙法將已培養(yǎng)3 d的根腐病菌打孔移取菌塊到PDA培養(yǎng)基中央,將4 片濾紙片(直徑5 mm)距平板邊緣2 cm成對角線貼在平板上,三片接入5 μL菌液,一片接入5 μL無菌水。28 ℃培養(yǎng)5 d,利用電子游標卡尺測量抑菌圈。
1.3 拮抗菌HB-3的鑒定
1.3.1 生理生化鑒定
參照《微生物分類學》[10]和《伯杰細菌鑒定手冊》[11]對菌株HB-3進行革蘭氏染色、芽孢染色鑒定,同時進行生化實驗鑒定。
1.3.2 分子生物學鑒定
提取拮抗菌HB-3的基因組DNA,以提取的DNA為模板(上游引物:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,下游引物:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成),聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增拮抗菌株的16S rDNA,PCR回收產(chǎn)物與載體pMD-18T連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,經(jīng)菌落PCR鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。并將獲得的序列與美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中已有的ITS基因序列進行比對分析,利用DNAstar構建系統(tǒng)進化樹,根據(jù)菌株間的親緣關系確定所選菌株HB-3的種屬。
1.4 拮抗菌HB-3的抑菌活性
1.4.1 HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌的拮抗活性測定
將拮抗菌HB-3 12 000 r/min離心后取上清液,經(jīng)濾器(直徑0.22 μm)過濾去除菌體獲得無菌發(fā)酵液。挑取一環(huán)人參根腐病菌菌絲在5 mL無菌水中混勻,均勻涂布在平板上,按1.2.2節(jié)方法測定無菌發(fā)酵液的拮抗活性。
1.4.2 不同體積分數(shù)HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌的拮抗活性測定
將無菌發(fā)酵液分別以體積分數(shù)1%、2%、5%、10%、20%的比例與PDA培養(yǎng)基混合,每平板10 mL混合培養(yǎng)基,在混合培養(yǎng)基中央放置人參根腐病的菌塊(直徑5 mm),每個處理3 個重復,設無菌水處理為空白對照,28 ℃培養(yǎng)4~5 d后測定菌落直徑,計算菌絲生長抑制率。
1.4.3 HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌孢子萌發(fā)的影響
將人參根腐病菌配制成孢子懸液,將孢子懸液分別與拮抗菌以體積分數(shù)5%、10%、20%、30%、50%的比例混合,每個處理3 個重復,設置無菌水與孢子懸浮液混合為對照,于28 ℃培養(yǎng)24 h后檢查孢子萌發(fā)情況(以孢子芽管長度大于孢子短半徑判定為萌發(fā)),計算孢子萌發(fā)抑制率。
1.5 拮抗菌HB-3抑菌譜的測定
采用平板對峙法將已培養(yǎng)3 d的供試人參病原菌(疫病菌、灰霉病菌、銹腐病菌、根腐病菌、菌核病菌),打孔取菌塊移到PDA培養(yǎng)基中央,4 周放置4 個直徑為5 mm的濾紙片,3 個接種待測拮抗菌菌懸液5 μL,1 個設置無菌水處理為對照,每處理3 個重復,28 ℃培養(yǎng)4~5 d后測定菌落直徑,計算菌絲生長抑制率。
1.6 數(shù)據(jù)處理
采用Microsoft Excel軟件和最小顯著差異法(least significance difference,LSD)進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計,用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。
2.1 人參根際土壤中拮抗菌HB-3的分離和篩選
采用平板稀釋法從人參根際土壤中分離出35 株菌株,利用平板對峙法篩選出9 株對人參根腐病菌有抑菌活性的拮抗菌(表1),其中菌株HB-3的抑菌活性最強,抑菌圈直徑達到46.5 mm,結果見圖1。
表1 拮抗菌HB-3對人參根腐病菌的抑菌活性Table 1 Antibiotic activity of antagonistic isolates on Fusarium solani
圖1 菌株HB-3對人參根腐病菌菌絲的拮抗作用Fig.1 Antagonistic activity of strain HB-3 against Fusarium solani
2.2 拮抗菌HB-3的鑒定
2.2.1 菌株HB-3培養(yǎng)形態(tài)特征及生理生化特征
菌株HB-3在NA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h,菌落呈圓形,乳白色,邊緣不規(guī)則,表面干燥褶皺,有黏性。鏡檢結果顯示,菌株HB-3呈桿狀,產(chǎn)芽孢,革蘭氏染色陽性,芽孢染色不著色,結合拮抗菌HB-3的生理生化特征(表2),初步鑒定拮抗菌HB-3為芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)。
表2 HB-3菌株的生理生化實驗結果Table 2 Physical and biochemical properties of strain HB-3
2.2.2 拮抗菌HB-3 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)進化樹構建
圖2 菌株HB-3 PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.2 Electrophoresis of PCR products from strain HB-3
圖3 菌株HB-3 16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of stain HB-3
以菌株HB-3基因組DNA為模板,利用16S rDNA細菌通用引物進行PCR擴增,測得菌株HB-3 16S rDNA核苷酸序列長度為1 472 bp(圖2),將序列通過NCBI比對后,選取相似序列構建系統(tǒng)進化樹(圖3)。結果表明,拮抗菌HB-3與Bacillus amyloliquefaciens strain RNB-1同源性達到100%,綜合菌體形態(tài)、生理生化實驗結果以及16S rDNA序列分析鑒定菌株HB-3為解淀粉芽孢桿菌。
2.3 拮抗菌HB-3的抑菌活性
2.3.1 HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌的拮抗活性
圖4 菌株HB-3無菌發(fā)酵液(A)以及不同體積分數(shù)無菌發(fā)酵液(B~F)對人參根腐病菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of sterile fermentation medium (A) and different concentrations (B-F) of cell-free fermentation fi ltrate on Fusarium solani
表3 菌株HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌菌絲生長的影響Table 3 Inhibition of HB-3 on mycelial growth of Fusarium sollaannii
如圖4和表3所示,拮抗菌HB-3的無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌具有較好的抑菌活性,隨著無菌發(fā)酵液體積分數(shù)的增加,人參根腐病菌菌落逐漸變小,菌絲變短減少。當添加無菌發(fā)酵液體積分數(shù)達到20%時,可明顯看出人參病原菌菌落顯著變小,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),菌落菌絲變形明顯,大部分菌絲彎曲,一部分出現(xiàn)斷裂,一部分菌絲出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象。
2.3.2 拮抗菌HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病病菌孢子萌發(fā)的影響
將人參根腐病菌孢子懸液與不同體積分數(shù)的拮抗菌HB-3無菌發(fā)酵液混合培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后利用光鏡檢查萌發(fā)的孢子數(shù)。如表4所示,隨著無菌發(fā)酵液體積分數(shù)的增加,萌發(fā)孢子數(shù)逐漸減少,當無菌發(fā)酵液體積分數(shù)達到50%,HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌孢子萌發(fā)抑制率最大,為72.3%。
表4 菌株HB-3無菌發(fā)酵液對人參根腐病菌孢子萌發(fā)率的影響Table 4 Inhibition of HB-3 on spore germination of Fusarium sollaannii
2.4 拮抗菌HB-3的抑菌譜
圖5 菌株HB-3的拮抗菌譜Fig.5 Antagonistic spectrum of strain HB-3
將菌株HB-3對5 株病原菌菌株進行抗菌譜測定。由圖5可知,菌株HB-3對人參根腐病菌、人參疫病菌、人參菌核病菌、人參灰霉病菌、人參銹腐病菌均有較好的抑菌作用。如表5所示,HB-3對人參根腐病菌的抑菌圈最大,直徑為46.5 mm,抑菌率達到64.2%;其次是人參疫病菌和人參菌核病菌,抑菌圈直徑分別為31.6 mm和23.4 mm,但對人參灰霉病菌的拮抗作用較差,抑菌率只有20.8%。
表5 菌株HB-3對5 種病原真菌菌落生長的抑菌作用Table 5 Diameters of Inhibition circles of HB-3 against 5 plant pathogens
本實驗采用平板稀釋法從10 份人參根系土壤中,分離得到35 株細菌,經(jīng)平板對峙實驗篩選到一株對人參根腐病菌具有較強拮抗作用的細菌HB-3,根據(jù)其菌落形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,將菌株HB-3鑒定為解淀粉芽孢桿菌。由于芽孢桿菌具有分布廣泛、抗逆性強,且無毒害作用等特征,一直以來都是防治植物病毒害生防菌中的最理想選擇[12]。解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的重要成員,其在生物防控方面的潛能也逐漸被發(fā)掘,Dionisio[13]利用Bacillus amyloliquefaciens DGA14防治香蕉的冠腐病取得了較好的效果;Chen Da等[14]利用Bacillus amyloliquefaciens S20控制茄子的細菌性枯萎病效果顯著;賈斌等[15]利用解淀粉芽孢桿菌拮抗人參黑斑病菌,抑制率達到80%;本實驗研究解淀粉芽孢桿菌HB-3對人參根腐病菌的抑制作用,結果表明菌株HB-3不僅對人參根腐病菌有較強的抑制作用和較好的防治效果,還對人參灰霉病菌、人參疫病菌、人參菌核病菌具有較強的抑菌活性,進一步驗證了HB-3是人參病害生物防治的良好資源,具有較大的開發(fā)潛能。
大量的實驗已經(jīng)表明拮抗菌對植物病害防治的作用機制主要包括兩種:一種是分泌抑菌物質(zhì);一種是競爭空間位點和營養(yǎng)[16]。本實驗中菌液與無菌發(fā)酵液的抑菌能力無明顯差異,故拮抗菌通過競爭空間位點和營養(yǎng)來抑制病原菌的可能性不大。一般認為拮抗菌能夠分泌抗菌蛋白[17]、多肽[18]、脂多糖[19]、生物堿[20]等多種抑菌活性物質(zhì),本實驗中HB-3無菌發(fā)酵液既可以抑制菌絲生長,又能抑制孢子萌發(fā),由此推斷菌株HB-3是通過分泌某種抑菌活性物質(zhì)來達到抑菌效果的。另外不同體積分數(shù)無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲孢子的抑制實驗表明,無菌發(fā)酵液的體積分數(shù)越大,對根腐病菌的抑制效果越明顯。當HB-3的無菌發(fā)酵液體積分數(shù)為20%時,對根腐病菌菌絲的生長抑制率達到86.6%,當HB-3的無菌發(fā)酵液體積分數(shù)為50%時,對根腐病菌孢子萌發(fā)抑制率達到72.3%,進一步說明了拮抗菌對根腐病菌的抑制活性與其所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的多少成正相關[21]。此外,將會在后續(xù)研究中進行HB-3抗菌活性物質(zhì)的分離純化與鑒定,同時還將研究HB-3對離體葉片及果實的防控效果,進而實行人參大田應用,以期開發(fā)出一種高效殺菌、環(huán)保友好型的微生物菌劑。
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Screening and Identifi cation of an Antagonistic Strain against Fusarium solani and Analysis of Its Antipathogenic Activity
GOU Changlong1, WANG Yuqiong1,2, SUN Peng1, BI Yanhui1, LOU Yujie1,2, GAO Yunhang1,*
(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Key Laboratory of Animal Production, Product Quality and Security, Ministry of Education, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)
Objective: An antagonistic strain against Fusarium solani was selected from the rhizosphere soil of ginseng, and its inhibitory effect on plant pathogens was researched preliminarily. Methods: The strain was separated from the rhizosphere soil of ginseng by the plate dilution method, selected directly using the pathogenic fungus Fusarium solani as the indicator strain, and identifi ed based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis. The effects of the cell-free fermentation fi ltrate on mycelial growth and spore germination of pathogenic fungi were determined. Meanwhile, the antagonistic spectrum of the antagonistic strain was assessed. Results: Strain HB-3 was isolated from the rhizosphere soil of ginseng and exhibited an excellent antagonistic effect on Fusarium solani. It was identifi ed as Bacillus amyloliquefaciens. Inhibition zone test and growth inhibition detection showed that strain HB-3 had the strongest inhibitory effect on mycelium and spores of pathogenic fungi, and displayed a wide antagonistic spectrum, suggesting obvious inhibition on fungal pathogens of ginseng such as Fusarium solani, Phytophthora cactorum, Cylindrocarpon destructans, Sclerotinia schinseng and Botrytis cinerea. Conclusion: Strain HB-3 has a strong effect on biological control of Fusarium solani showing a signifi cant inhibitory effect on the growth of the pathogenic fungus.
Fusarium solani; Bacillus amyloliquefaciens; cell-free fermentation fi ltrate; antagonistic spectrum
S872
A
1002-6630(2015)19-0143-05
10.7506/spkx1002-6630-201519025
2014-10-23
國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-38);2013年公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303091)
勾長龍(1988-),男,博士,研究方向為微生態(tài)學。E-mail:543135734@qq.com
*通信作者:高云航(1975-),男,副教授,博士,研究方向為微生態(tài)學。E-mail:gaoyunhang@163.com