朱云輝，郭元新

（安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

響應(yīng)面法優(yōu)化鹽脅迫發(fā)芽苦蕎富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件

朱云輝，郭元新*

（安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

為優(yōu)化鹽脅迫條件下發(fā)芽苦蕎富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的最優(yōu)培養(yǎng)條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法探討NaCl濃度、發(fā)芽時間和發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎中GABA含量的影響。結(jié)果表明：發(fā)芽苦蕎在鹽脅迫條件下富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為：NaCl濃度34 mmol/L、發(fā)芽時間5 d、發(fā)芽溫度31 ℃，在此條件下發(fā)芽苦蕎中GABA富集量為250.06 μg/g（以干質(zhì)量計(jì)）。方差分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，模型具有極顯著的可靠性和擬合度（R2=0.961 1），可準(zhǔn)確預(yù)測鹽脅迫條件下苦蕎發(fā)芽過程中GABA的富集量。

苦蕎；發(fā)芽；鹽脅迫；γ-氨基丁酸富集；響應(yīng)面分析法

苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn）是一種蓼科蕎麥屬雙子葉植物，又名韃靼蕎麥、烏麥，是我國傳統(tǒng)優(yōu)勢小雜糧，在我國西北和西南等地區(qū)廣有種植，作為營養(yǎng)豐富的食藥兩用作物，日益受到人們的推崇[1-3]。但苦蕎含有蛋白酶抑制劑、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，其營養(yǎng)價值還有待改善[4-5]。有研究表明，苦蕎發(fā)芽后，氨基酸組成更加合理，可降低或消除抑制劑活性，并可富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、黃酮類物質(zhì)等功能性成分[2,4,6]。

GABA是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動植物體內(nèi)，具有促進(jìn)記憶、降壓、改善腦機(jī)能、緩解焦慮和頭痛等功能，從食品中獲得GABA有促進(jìn)人體健康的作用，因而富含GABA的食品開發(fā)備受科技工作者的重視[7-12]。GABA在高等植物中的合成主要來自GABA支路和多胺降解途徑，起主導(dǎo)作用的酶分別為谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO，EC 1.4.3.6）[13-14]。

當(dāng)植物受到逆境脅迫時，可刺激GAD和DAO活性，繼而促進(jìn)GABA含量積累，其中鹽脅迫是一種安全、便捷、環(huán)保的脅迫方式[15]。Bai Qingyun等[16]利用不同濃度的NaCl溶液對發(fā)芽粟谷進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)GABA含量最高可達(dá)到23.42 mg/100 g，是對照的1.48 倍。郭元新等[15]研究了NaCl濃度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度對大豆發(fā)芽富集GABA的影響，結(jié)果表明，優(yōu)化出的最佳條件可使GABA含量較原料增加6.47 倍。但目前有關(guān)苦蕎在發(fā)芽過程中利用NaCl脅迫富集GABA的研究還未見報(bào)道，其培養(yǎng)條件有待進(jìn)一步探明。本研究利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化鹽脅迫條件下發(fā)芽苦蕎富集GABA的最佳培養(yǎng)條件，以期為苦蕎功能性食品的開發(fā)和苦蕎產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎（榆6-21），千粒質(zhì)量22.4 g，2013年秋產(chǎn)自中國內(nèi)蒙古自治區(qū)，購買后置于－20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

GABA標(biāo)品（純度≥99.9%）、對二甲氨基苯磺酰氯（dabsyl chloride，DABS-CI，純度99%） 美國Sigma公司；乙腈為色譜純，NaCl等其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LHP-160型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜儀 美國安捷倫公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī) 合肥科大創(chuàng)新股份有限公司；真空冷凍干燥系統(tǒng) 美國Labconce公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA含量的測定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），條件參照Guo Yuanxin等[17]的方法，結(jié)果以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

取30 g苦蕎種子用去離子水清洗后，用1%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，用去離子水沖洗至pH值中性，在去離子水中30 ℃浸泡4 h后，放入鋪有兩層濾紙的φ= 9 cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放置約100 粒種子，然后放入生化培養(yǎng)箱中30 ℃暗發(fā)芽，發(fā)芽相對濕度為85%～90%左右，期間每8 h噴中性的NaCl溶液或去離子水（對照）1 次。

單因素試驗(yàn)處理如下：1）樣品分別用0、25、50、75、100 mmol/L的NaCl溶液脅迫處理，發(fā)芽溫度30 ℃，培養(yǎng)4 d后取樣測GABA；2）樣品用上一步驟中所得的最佳脅迫NaCl濃度，進(jìn)行脅迫處理，發(fā)芽溫度30 ℃，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8 d；3）樣品用最佳脅迫NaCl濃度進(jìn)行脅迫處理，分別置于15、20、25、30、35 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)暗發(fā)芽，發(fā)芽時間為上一步驟中所得的最佳培養(yǎng)天數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束后，用去離子水清洗發(fā)芽苦蕎，用吸水紙吸干水分，冷凍干燥后去殼，粉碎至過80 目篩后待測。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇NaCl濃度、發(fā)芽時間、發(fā)芽溫度3 個因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以苦蕎GABA含量為響應(yīng)值，優(yōu)化出響應(yīng)值與變量間的二次多項(xiàng)方程。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果以±s表示。響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析采用Design Expert軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl濃度對發(fā)芽苦蕎GABA富集的影響

圖1 NaCl濃度對發(fā)芽苦蕎GABA富集的影響Fig.1 Effect of NaCl content on GABA accumulation in germinated tartary buckwheat under salt stress

如圖1所示，發(fā)芽4 d時，各濃度NaCl對發(fā)芽苦蕎較對照均有顯著影響（P＜0.05），濃度在0～25 mmol/L變化時，GABA含量逐漸增加，在25 mmol/L的NaCl溶液脅迫時GABA含量達(dá)到最大，為247.22 μg/g，是對照組的1.39 倍。當(dāng)濃度高于25 mmol/L時，GABA含量緩慢下降。

2.2 鹽脅迫下發(fā)芽時間對發(fā)芽苦蕎GABA富集的影響

圖2 發(fā)芽時間對發(fā)芽苦蕎GABA富集的影響Fig.2 Effect of germination time on GABA accumulation in germinated tartary buckwheat

如圖2所示，不同發(fā)芽時間對苦蕎富集GABA有顯著影響（P＜0.05）。當(dāng)NaCl濃度為25 mmol/L時，脅迫組苦蕎在發(fā)芽2～8 d時的GABA含量是相應(yīng)對照組的1.23～1.39 倍，說明鹽脅迫有利于GABA的富集。在鹽脅迫條件下，發(fā)芽4 d時GABA含量達(dá)到最大，為246.80 μg/g，是0 d的2.44 倍，是對照的1.39 倍。

2.3 鹽脅迫下發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎GABA富集的影響

圖3 鹽脅迫條件下溫度對發(fā)芽苦蕎GABA富集的影響Fig.3 Effect of temperature on GABA accumulation in germinated tartary buckwheat under salt stress

如圖3所示，鹽脅迫濃度25 mmol/L、發(fā)芽4 d的培養(yǎng)條件下，隨著溫度的升高，發(fā)芽苦蕎中的GABA含量逐漸增大，在30 ℃達(dá)到最大值248.06 μg/g，是15 ℃的1.65 倍，各處理溫度間差異顯著（P＜0.05）。

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1，利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得描述GABA含量與自變量NaCl濃度、發(fā)芽時間和發(fā)芽溫度的二次多項(xiàng)式如下，根據(jù)公式所得預(yù)測值見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Box-Behnken design with predicted and experimental values of GABA content in germinated tartary buckwheat

方差分析表明（表2），模型的總決定系數(shù)為0.961 1，F(xiàn)約為19.20，P＜0.01，說明模型達(dá)到極顯著；模型的失擬性檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），校正決定系數(shù)說明該模型能解釋91.10%響應(yīng)值的變化；比較模型的預(yù)測值和觀察值（圖4），二者具有極顯著的相關(guān)性；模型的信噪比（RSN）為11.078，遠(yuǎn)大于4。綜合所有統(tǒng)計(jì)分析特征值表明，模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用來分析發(fā)芽苦蕎GABA含量與各自變量之間的關(guān)系。

表2 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) for the regression equation

圖4 GABA含量預(yù)測值和觀察值之間的相關(guān)性Fig.4 Correlation between predicted and experimental values of GABA content

2.5 鹽脅迫下發(fā)芽苦蕎富集GABA含量的響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化

根據(jù)回歸方程（1）作出響應(yīng)面圖和等高線圖，可分析各變量之間的變化關(guān)系。圖5A表示當(dāng)發(fā)芽溫度固定在30 ℃時，NaCl濃度與發(fā)芽時間對發(fā)芽苦蕎GABA富集量的影響。NaCl濃度與發(fā)芽時間的一次項(xiàng)（P＜0.01）和二次項(xiàng)（P＜0.01）對GABA的富集量有極顯著的影響，NaCl濃度與發(fā)芽時間的交互作用顯著（P＜0.05）。在時間一定的條件下，GABA的含量隨著NaCl濃度的升高先增加后降低，在33.99 mmol/L處有最高值，說明GABA含量受到NaCl脅迫的影響，且脅迫濃度達(dá)到33.99 mmol/L時有利于其富集GABA。Fougere等[18]研究表明，鹽脅迫誘導(dǎo)紫花苜蓿根中氨基酸和碳水化合物大量合成，GABA含量也有不同程度的提高。鹽脅迫下發(fā)芽大豆[14]和玉米幼苗中[19]GABA的富集量隨著脅迫強(qiáng)度的增大而提升。陳惠等[20]認(rèn)為0～40 mmol/L的NaCl處理提高了發(fā)芽蠶豆中GAD和DAO的活性，進(jìn)而使發(fā)芽蠶豆中GABA含量升高。植物受到鹽脅迫時，可使其細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度提高，繼而促進(jìn)CaM轉(zhuǎn)錄水平提高，提高GAD活性，同時也可導(dǎo)致游離多胺含量的提升，DAO活性增強(qiáng)，這些變化均導(dǎo)致GABA的富集[16,21]。在鹽濃度一定的條件下，發(fā)芽時間從0～5.06 d時，GABA含量快速提升，繼續(xù)培養(yǎng)，GABA含量則出現(xiàn)下降趨勢，表明培養(yǎng)5.06 d時有利于GABA的積累。

圖5 各兩因素交互作用對發(fā)芽苦蕎GABA含量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagrams for the effects of three factors on GABA accumulation in germinated tartary buckwheat

圖5B顯示了NaCl濃度和發(fā)芽溫度對發(fā)芽苦蕎GABA含量的影響。模型分析表明，NaCl濃度與溫度的交互作用不顯著（P＞0.05）。在NaCl濃度一定的情況下，隨著溫度的升高，GABA含量隨之增加，并在30.82 ℃時培養(yǎng)達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度后，GABA含量緩慢下降。溫度會影響酶蛋白的構(gòu)象、酶與激活劑的親和力及參與酶促反應(yīng)功能團(tuán)的解離等[22]。Zhang Hui等[21]的研究表明40 ℃是植物體內(nèi)GAD活性達(dá)到最高時的溫度，因種間差異，粟谷[22]富集GABA的最高溫度為33 ℃，大豆[23]富集GABA的最適溫度約為30.5～33.3 ℃，而米胚[24]和米糠[25]分別為40 ℃和41.3 ℃。較高的溫度有利于刺激GAD活性從而達(dá)到GABA快速富集的目的，然而苦蕎具有耐嚴(yán)寒、生性好陰冷的生長特性[3]，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃（數(shù)據(jù)未顯示）時反而不利于其生長，直至死亡。

由圖5C可知，發(fā)芽溫度與發(fā)芽時間的交互作用不顯著（P＞0.05）。隨著發(fā)芽溫度的升高和發(fā)芽時間的延長，GABA含量增加，但發(fā)芽溫度過高和發(fā)芽時間過長都不利于苦蕎中GABA的積累。

綜上，根據(jù)響應(yīng)面的試驗(yàn)結(jié)果，確定回歸模型預(yù)測發(fā)芽苦蕎富集GABA量的最佳培養(yǎng)條件為：NaCl濃度33.99 mmol/L、發(fā)芽時間為5.06 d、發(fā)芽溫度30.82 ℃，預(yù)測的GABA最佳含量為252.28 μg/g。為考察模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的可行性，將發(fā)芽條件改進(jìn)為：NaCl濃度34 mmol/L、發(fā)芽時間5 d、發(fā)芽溫度31 ℃，得到的GABA含量為（250.06±10.15） μg/g，與理論值的相對誤差較小，故可認(rèn)為響應(yīng)面優(yōu)化鹽脅迫富集發(fā)芽苦蕎GABA的培養(yǎng)條件是有效可行的。

3 結(jié) 論

NaCl濃度和發(fā)芽時間均極顯著地影響發(fā)芽苦蕎富集GABA，發(fā)芽溫度對GABA富集的影響顯著，NaCl濃度與發(fā)芽時間的交互作用顯著（P＜0.05）。響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)芽苦蕎富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為：NaCl濃度34 mmol/L、發(fā)芽時間5 d、發(fā)芽溫度31 ℃，此條件下GABA的富集量為（250.06±10.15）μg/g，與理論值基本相符，說明所建模型是可靠的。研究表明，鹽脅迫萌發(fā)處理可有效提高苦蕎GABA的含量。

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Optimization of Culture Conditions for Accumulating γ-Aminobutyric Acid (GABA) in Germinated Tartary Buckwheat under Salt Stress by Response Surface Methodology

ZHU Yunhui, GUO Yuanxin*
(College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

In order to optimize the culture conditions for γ-aminobutyric acid (GABA) production in germinated tartary buckwheat under salt stress, the effects of NaCl content, germination time and germination temperature on the accumulation of GABA during the germination of tartary buckwheat were explored by response surface methodology (RSM). Results showed that the optimal conditions with salt stress for GABA accumulation in germinated tartary buckwheat were determined as NaCl content of 34 mmol/L, germination time of 5 days and germination temperature of 31 ℃. Under the optimal conditions, the predicted highest GABA yield of 250.06 μg/g DW was obtained. Analysis of variance and validation experiments suggested that the proposed regression model was extremely signifi cant (P ＜ 0.01) with R2of 0.961 1 and could accurately predict the accumulation of GABA in germinated tartary buckwheat under salt stress. This study can provide the theoretical basis for future development of GABA-rich tartary buckwheat-based foods.

tartary buckwheat; germination; salt stress; γ-aminobutyric acid (GABA) accumulation; response surface analysis

TS201.1

A

1002-6630（2015）19-0096-05

10.7506/spkx1 002-6630-201519017

2014 -12-12

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1308085MC32）

朱云輝（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭δ苄猿煞值母患捌焚|(zhì)控制。E-mail：zyh172926966@163.com

*通信作者：郭元新（1970-），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及品質(zhì)控制。E-mail：guoyuanxiner@163.com