周慧吉，馬海樂(lè)，郭丹釗，王振斌

（江蘇大學(xué) 江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃胞內(nèi)多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性

周慧吉，馬海樂(lè)*，郭丹釗，王振斌

（江蘇大學(xué) 江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

研究桑黃胞內(nèi)多糖醇沉過(guò)程中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率、純度、理化性質(zhì)和抗氧化活性等的影響。結(jié)果表明：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，沉淀粗多糖的得率增加，而粗多糖中多糖含量呈現(xiàn)不規(guī)則的變化；不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀獲得的桑黃多糖中均含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖。掃描電鏡圖像顯示，低體積分?jǐn)?shù)（65%、75%、85%）乙醇沉淀的多糖呈現(xiàn)均勻球狀，高體積分?jǐn)?shù)（95%)乙醇沉淀的多糖連成大塊片狀。桑黃胞內(nèi)多糖體外抗氧化能力存在明顯的量-效關(guān)系，95%乙醇沉淀的多糖對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基的清除效果最好，對(duì)Fe3+的還原能力最強(qiáng)，抗氧化活性最高。

桑黃；胞內(nèi)多糖；理化性質(zhì)；體外抗氧化活性

桑黃是我國(guó)的一種傳統(tǒng)藥物，通常生長(zhǎng)在桑屬植物上，因其子實(shí)體顏色鮮黃而俗稱為桑黃。桑黃的主要活性成分是桑黃多糖和黃酮類化合物[1-2]。有關(guān)研究證明，桑黃多糖具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗肝硬化和保肝等活性功能[3-4]。由于桑黃自然生長(zhǎng)緩慢，液體發(fā)酵成為了工業(yè)化高效制備桑黃多糖的重要途徑[5-6]。醇沉是從發(fā)酵提取液中分離多糖的主要方法，乙醇體積分?jǐn)?shù)直接影響著所獲得多糖的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)。本研究在前期優(yōu)化桑黃菌絲體液體發(fā)酵及其胞內(nèi)多糖提取技術(shù)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)針對(duì)利用乙醇沉淀獲取提取液粗多糖的過(guò)程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率、純度、理化性質(zhì)和抗氧化活性等的影響開展研究，旨在為桑黃多糖的高效制備和科學(xué)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

桑黃菌株（菌株編號(hào)為5.95），購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

氯仿、正丁醇、鹽酸羥胺、吡啶、鹽酸、苯酚、水楊酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基由小麥粉51.6 g、米糠13.8 g、磷酸二氫鉀0.9 g、硫酸鎂0.54 g組成，加自來(lái)水配制至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

CARY紫外掃描分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安公司；YC-211恒溫培養(yǎng)搖床 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HP6890N氣相色譜儀、DEC-A2型表面處理儀、HITACHI S-570型掃描電子顯微鏡 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶液體發(fā)酵

在250 mL三角瓶中裝100 mL配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基，按體積分?jǐn)?shù)10%的量接種桑黃菌種，發(fā)酵溫度為27.5 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為125 r/min，發(fā)酵時(shí)間為7 d，發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾菌絲，冷凍干燥后備用[7]。

1.3.2 桑黃粗多糖的提取與醇沉實(shí)驗(yàn)

將干燥的桑黃菌絲體碾磨粉碎。加入10 倍體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，靜置12 h，5 000 r/min離心10 min去除上清液，旨在脫除黃酮類物質(zhì)。離心殘?jiān)邪凑?∶30 （m/V）的料液比加入水，于100 ℃水浴鍋中水煮2 h，以同樣的料液比水煮3 次。10 000 r/min離心15 min后收集上清液[8-9]，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來(lái)體積的1/4。分別加入4 倍體積分?jǐn)?shù)為65%、75%、85%、95%的乙醇，過(guò)夜。10 000 r/min離心10 min取沉淀，真空冷凍后即得到桑黃粗多糖[10]。研究不同體積分?jǐn)?shù)醇沉多糖的組成及其特性。

1.3.3 桑黃多糖的檢測(cè)分析

按照上述提取條件對(duì)Sevag法[11]除蛋白后得到的粗多糖的多糖含量、單糖組成、紅外光譜、體外抗氧化活性、電鏡掃描進(jìn)行測(cè)試分析。

1.3.3.1 多糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12-13]的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和桑黃多糖含量的測(cè)定，通過(guò)式（1）、（2）計(jì)算粗多糖得率及多糖含量。

1.3.3.2 單糖組成分析

采用糖精乙酸酯作為衍生物，氣相色譜法測(cè)定桑黃多糖的單糖組成[12]。

1.3.3.3 黃酮含量測(cè)定

用電子天平精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，于25 mL容量瓶中，并用70%乙醇溶解定容，配制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻靜置6 min。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁1 mL，搖勻靜置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3%氫氧化鈉10 mL，最后加蒸餾水定容，搖勻靜置15 min。空白參照液直接加入6 mL蒸餾水，后面依次加入相同的試劑。用紫外分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取各粗多糖樣品0.5 g加6 mL蒸餾水，按上述方法測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮含量。

1.3.3.4 紅外光譜掃描[13]

取樣品l mg，溴化鉀壓片，測(cè)定范圍4 000～400 cm－1。

1.3.3.5 體外抗氧化活性測(cè)定

采用文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定；采用文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定；參照Rice-Evans等[16]所報(bào)道的方法進(jìn)行水溶性VE（trolox）等價(jià)抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）測(cè)定；采用文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant potential assay，F(xiàn)RAP）的測(cè)定。

1.3.3.6 掃描電鏡觀察

將凍干的多糖樣品直接壓在涂過(guò)導(dǎo)電銀膠的樣品臺(tái)上，用DEC-A2型表面處理儀噴鍍金原子，采用HITACHI S-570型掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃粗多糖中多糖含量

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑黃粗多糖中多糖含量的影響Table 1 Effect of alcohol concentration on crude polysaccharide yield and protein content

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃粗多糖得率及其多糖含量如表1所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，沉淀粗多糖的得率增加，而粗多糖中多糖含量呈現(xiàn)不規(guī)則的變化，其主要原因可能在于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值之后，乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化更多的是影響到沉淀中粗多糖的結(jié)構(gòu)，因?yàn)榈腕w積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀下來(lái)的主要是高分子質(zhì)量的多糖、高體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀下來(lái)的則是較小分子質(zhì)量的多糖和低聚糖。分子質(zhì)量越小，分子中的自由氨基越多，可能致使其活性增強(qiáng)[18-19]。當(dāng)然多糖的生物活性不僅與分子質(zhì)量大小有關(guān)，還與其立體結(jié)構(gòu)、糖單元的組成、糖苷鍵的類型、取代基的種類及數(shù)量等都有密切關(guān)聯(lián)[20-21]。后續(xù)將研究不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀所得多糖的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的變化。各粗多糖樣品在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度均基本為0.0，說(shuō)明粗多糖中不存在或存在非常少的黃酮類物質(zhì)。

2.2 桑黃粗多糖中單糖組成分析

采用鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6 種標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品作為參照，進(jìn)行桑黃粗多糖的單糖組成分析。標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖如圖1所示，不同體積分?jǐn)?shù)醇沉多糖的氣相色譜圖如圖2所示，其定量分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of mixed monosaccharide standards

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀樣品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of samples precipitated by different alcohol concentrations

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)單糖組分的影響Table 2 Effect of alcohol concentration on monosaccharide composition of crude polysaccharides

由表2和圖2可知，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖樣品單糖組成相似，均含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，但單糖組成比例有一定的差異。此外，4 種樣品均包含1 種未知單糖成分，其出峰時(shí)間大約在6.5 min左右，該單糖峰在4 種樣品中的含量也略有差異。

2.3 桑黃多糖的紅外光譜分析

用來(lái)檢測(cè)化合物結(jié)構(gòu)的紅外光譜通常指波數(shù)在4 000～400 cm－1之間的中紅外光譜。其具有高度的特征性，能夠測(cè)定分子內(nèi)部原子間的相對(duì)振動(dòng)和分子轉(zhuǎn)動(dòng)等信息，是研究聚合物結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，表征或鑒別不同化合物的常用手段之一。由于多糖的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，所以多糖的紅外光譜具有某些相同的特征吸收峰[22]。在紅外光譜中，3 400 cm－1附近是O-H和N-H鍵較強(qiáng)的伸縮振動(dòng)吸收峰，在2 920 cm－1附近的吸收峰是-CH2或-CH3中C-H鍵的伸縮振動(dòng)引起的，在1 600 cm－1附近的吸收峰可能是COO-中的C=O鍵的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的或是N-H變角振動(dòng)引起的，1 400 cm－1附近的吸收峰可能是由-COOH中的C-O鍵伸縮振動(dòng)或是C-H鍵的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)引起的；1 000 cm－1附近的吸收峰是由C-O-H和吡喃糖環(huán)的C-O-C中的兩種C-O鍵的伸縮振動(dòng)引起的。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取桑黃多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

由圖3可知，所有的多糖均在3 420、2 900、1 400、1 100 cm－1這4 個(gè)區(qū)域出現(xiàn)糖類物質(zhì)的典型特征吸收峰，而且在1 000～800 cm－1間有許多弱小吸收峰，說(shuō)明可能含有β-D-吡喃葡萄糖環(huán)，可能以β-糖苷鍵連接。可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖在結(jié)構(gòu)上并無(wú)明顯不同。

2.4 桑黃多糖的形態(tài)

圖4 桑黃多糖的掃描電鏡圖Fig.4 SEM ima ges of polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

圖4是不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃多糖的掃描電鏡圖。可以看出65%、75%、85%乙醇沉淀的多糖呈球狀，比較均勻。95%乙醇沉淀的多糖會(huì)有大塊片狀出現(xiàn)。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，桑黃多糖粒徑增大，緊密度減小，變得松散，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時(shí)，桑黃多糖已經(jīng)連成片狀。

2.5 桑黃多糖的體外抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除效果

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃多糖的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rates of Phellinus igniarius polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

由圖5可知，低體積分?jǐn)?shù)乙醇提取的桑黃多糖，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率升高，且量-效關(guān)系明顯，但是桑黃多糖質(zhì)量濃度較高時(shí)，其DPPH自由基清除率略微下降，有可能是乙醇將多糖析出，從而了影響體系吸光度。桑黃多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的多糖對(duì)DPPH自由基的清除率分別為（33.85±2.00）%、（29.61±0.05）%、（40.40±0.15）%和（40.57±1.35）%。95%乙醇提取的桑黃多糖對(duì)DPPH自由基清除率最高，是75%體積分?jǐn)?shù)乙醇的1.31 倍。

2.5.2 ·OH清除效果

圖6 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃多糖的·OH清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of Phellinus igniarius polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

圖6是不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖對(duì)·OH清除率的影響。隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)反應(yīng)體系產(chǎn)生的·OH的清除率增大，量-效關(guān)系非常明顯。在相同質(zhì)量濃度下，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的桑黃多糖清除·OH的IC50分別為3.19、3.60、3.86、3.18 mg/mL。IC50越小，說(shuō)明所需的多糖質(zhì)量濃度越低，其抗氧化性越好。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇制取的桑黃多糖對(duì)·OH清除效果只有略微差別。

2.5.3 TEAC值

以水溶性VE為參照物，測(cè)得不同質(zhì)量濃度水溶性VE與TEAC值的校準(zhǔn)曲線方程為y=0.891 7x+0.028 3 （R2=0.998 8）。圖7是不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃多糖的TEAC值，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的桑黃多糖的TEAC值分別為（0.149±0.006）、（0.122±0.004）、（0.141±0.006）、（0.176±0.005） μmol/mg。

圖7 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃多糖的TEAC值Fig.7 TEAC values of polysaccharide precipitated by different ethanol concentrations

2.5.4 FRAP值

以FeSO4為參照物，測(cè)得不同質(zhì)量濃度FeSO4與FRAP值的校準(zhǔn)曲線方程為y=0.018 1x－0.017 5（R2= 0.994 1）。圖8是不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃多糖的FRAP值，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的桑黃多糖得到的FRAP值分別為（9.59±0.20）、（8.56±0.04）、（10.58±0.32）、（10.66±0.45）mmol/L。

圖8 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃多糖的FRAP值Fig.8 FRAP values of polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)初步研究了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)桑黃胞內(nèi)多糖的提取、理化性質(zhì)和單糖組成的影響，并以此為基礎(chǔ)探討桑黃胞內(nèi)多糖的體外抗氧能力，為深入研究桑黃多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的構(gòu)效關(guān)系提供參考。

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀可能會(huì)影響桑黃多糖的分子質(zhì)量、糖單元組成、立體結(jié)構(gòu)，從而改變多糖的生物活性。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，粗多糖的得率增加，而粗多糖中多糖含量呈現(xiàn)不規(guī)則的變化；不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀獲得的桑黃多糖中均含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，但是各種多糖間比例存在差異，并且4 種樣品中均檢測(cè)出一種未知成分。紅外光譜掃描結(jié)果顯示65%、75%、85%、95%乙醇沉淀獲得的樣品均在3 420、 2 900、1 400、1 100 cm－1區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)糖類物質(zhì)的典型特征吸收峰，并且都含有β-D-吡喃葡萄糖環(huán)，在結(jié)構(gòu)上類似；而單糖成分及結(jié)構(gòu)的差異性也會(huì)引起桑黃多糖生物活性的差異性[23-24]。

掃描電鏡圖像顯示，低體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖呈現(xiàn)均勻球狀，高體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的多糖連成大塊片狀。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，桑黃多糖粒徑增大，緊密度減小，松散度增加；桑黃胞內(nèi)多糖體外抗氧化能力存在明顯的量-效關(guān)系，95%乙醇沉淀的桑黃多糖抗氧化活性最高，其對(duì)DPPH自由基清除率為40.57%、清除·OH的IC50為3.18 mg/mL、TEAC值為0.176 μmol/mg、FRAP值為10.66 mmol/L。

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Physicochemical Properties and Antioxidant Activity of Intracellular Polysaccharides from Phellinus igniarius Precipitated by Different Ethanol Concentrations

ZHOU Huiji, MA Haile*, GUO Danzhao, WANG Zhenbin
(Key Laboratory of Physical Processing of Agricultural Products in Jiangsu Province, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In this study, the effect of ethanol concentration on the yield, purity, physicochemical properties and antioxidant activity of intracellular polysaccharides (IPs) isolated from Phellinus igniarius was analyzed. Results indicated that with an increase in ethanol concentration, the yield of crude polysaccharides increased, but polysaccharide content of the precipitated crude polysaccharides changed irregularly. Each of the IPs precipitated by different concentrations of ethanol contained xylose, mannose, galactose and glucose. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IPs precipitated by low concentration (65%、75%、85%) of ethanol presented a uniform spherical shape, whereas those precipitated by high concentration (95%) of ethanol were clustered into large fl akes. IPs of Phellinus igniarius had obvious antioxidant activity in vitro in a dose-dependent manner and the IPs precipita ted by 95% ethanol had the best scavenging activity against DPPH, hydroxyl and ABTS+free radicals and the strongest ferric reducing antioxidant power.

Phellinus ign iarius; intracellular polysaccharides (IPs); physicochemical properties; antioxidant activity in vitro

TS205.9

A

1002-6630（2015）19-0034-05

10.7506/spkx1002-6630-201519006

2014-11-19

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD36B05）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年 科學(xué)基金項(xiàng)目（31301544）；鎮(zhèn)江市科技支撐計(jì)劃工業(yè)項(xiàng)目（GY20130018）

周慧吉（1990-），女，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：zhouhuiji0523@163.com

*通信作者：馬海樂(lè)（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：mhl@ujs.edu.cn