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        紫外光輻照對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

        2015-12-20 07:56:02鄒忠義李洪軍
        食品科學(xué) 2015年19期
        關(guān)鍵詞:單端工作液紫外光

        鄒忠義,黃 斐,李洪軍*

        (1.公安海警學(xué)院后勤管理系,浙江 寧波 315801;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400716)

        紫外光輻照對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

        鄒忠義1,黃 斐1,李洪軍2,*

        (1.公安海警學(xué)院后勤管理系,浙江 寧波 315801;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400716)

        目的:研究紫外光輻照對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和T-2毒素的去除作用。方法:測(cè)定不同輻照時(shí)間、不同輻照距離、不同pH值條件下紫外光輻照對(duì)DON和T-2毒素影響,采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定毒素及其衍生物,外標(biāo)法定量。結(jié)果:經(jīng)紫外光輻照后,溶液中DON、T-2毒素的質(zhì)量濃度均隨著輻照時(shí)間的延長而不斷減小,隨著輻照距離和pH值的減小而不斷減小。pH 7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素溶液,在紫外燈功率20 W、輻照距離150 mm條件下輻照60 min后,DON、T-2毒素去除率分別為(84.90±2.52)%、(74.60±2.74)%。紫外光輻照后,毒素溶液中不含有已知的毒素衍生物,可能被轉(zhuǎn)化成新的未知產(chǎn)物。結(jié)論:在非堿性條件下,紫外光輻照對(duì)DON、T-2毒素具有明顯的去除作用。

        脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;T-2毒素;紫外光輻照;高效液相色譜-質(zhì)譜

        單端孢霉烯族毒素(trichothecenes)是由鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物,按結(jié)構(gòu)分成4 種類型:A、B、C、D型[1]。污染食品和動(dòng)物飼料的主要是A、B型單端孢霉烯族毒素,A型中的T-2毒素是毒性最強(qiáng)的單端孢霉烯族毒素[2],B型中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是食品和飼料中最常見的單端孢霉烯族毒素[3]。單端孢霉烯族毒素對(duì)人和動(dòng)物具有多種毒性,能夠造成嘔吐、腹瀉、皮膚刺激、拒食、惡心、神經(jīng)障礙、流產(chǎn)等急性和慢性疾病[4],高劑量的單端孢霉烯族毒素還能促進(jìn)白細(xì)胞快速凋亡[5]。它們?cè)诟鞣N環(huán)境條件下普遍存在[6],目前還沒有完全有效地防止其污染的方法,不僅帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也對(duì)人類食品安全造成巨大的威脅,所以控制食品和飼料中的真菌毒素污染是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)[7]。輻照被用來研究滅活真菌毒素或降低真菌毒素在食品和飼料中的含量[8-12]。目前關(guān)于輻照去除單端孢霉烯族毒素的研究主要是利用γ射線輻照和電子束輻照。Hooshmand等[13]研究了γ射線輻照對(duì)DON 和T-2毒素的影響,7.5、20 kGy劑量分別能顯著減少T-2毒素、DON的質(zhì)量濃度。O’Neill等[14]研究了DON在60Co-γ射線輻照中的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)水溶液中的DON比玉米中的DON對(duì)輻照更敏感,水溶液中DON質(zhì)量濃度在輻照劑量為1 kGy時(shí)開始降低,50 kGy時(shí)能完全破壞掉DON,玉米中DON質(zhì)量濃度在輻照劑量為20 kGy時(shí)才開始降低,50 kGy時(shí)仍保留80%~90%的DON,用幼鼠腎臟細(xì)胞做毒性實(shí)驗(yàn),沒發(fā)現(xiàn)新的毒性物質(zhì)。但在干燥狀態(tài)、輻照劑量為50 kGy時(shí),DON仍能保持穩(wěn)定。Stepanik[15]、Kottapalli[16]等研究了電子束輻照對(duì)DON的影響,發(fā)現(xiàn)6~10 kGy的輻照劑量不能降低大麥中DON的質(zhì)量濃度,55.8 kGy劑量的電子束能降低小麥中17.6%的DON,但對(duì)干燥狀態(tài)的DON并無影響。目前關(guān)于紫外光輻照去除單端孢霉烯族毒素的研究報(bào)道較少,在很多方面研究數(shù)據(jù)還處于空白狀態(tài),本實(shí)驗(yàn)將研究紫外光輻照對(duì)單端孢霉烯族毒素的去除作用,探索其去除作用機(jī)理,為控制此類真菌毒素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        標(biāo)準(zhǔn)品DON、脫環(huán)氧DON(deepoxydeoxynivalenol,DOM-1)、3-乙酰-DON(3-acetyldeoxynivalenol,3-A-DON)、15-乙酰-DON(15-acetyldeoxynivalenol,15-A-DON)、DON-3-葡萄糖苷、T-2毒素、HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇、新茄病鐮刀菌烯醇(neosolaniol,NEO)、T-2四醇四乙酸酯(純度均≥99%),甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨均為色譜純 美國Sigma-Aldrich公司;鹽酸、氫氧化鈉均為分析純 重慶博藝化學(xué)試劑有限公司;超純水通過Milli-Q純水儀制備 美國Millipore公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UFLC LC-20AD高效液相色譜儀、Shim-peak UPODS分離柱(150 mm×4.6 mm,3.0 μm)、Shimpeak GPRC-ODS保護(hù)柱(8 mm×1.5 mm,5.0 μm)日本Shimadzu公司;Sciex API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源及Analyst software 1.5.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 美國Applied Biosystems公司;美泰t8紫外燈 海寧市海仕照明電器廠;Finnpipette移液器美國Thermo Scientific公司;CPA225D電子天平 德國Sartorius公司;S20P-K pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司;XW-80A漩渦混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;SIGMA 3-30k離心機(jī) 美國Sigma-Aldrich公司;N-EVAPTM 116氮吹儀 美國Organomation Associates公司;聚四氟乙烯濾膜(直徑17 mm,孔徑0.22 μm) 丹麥Frisenette公司。

        1.3 方法

        1.3.1 毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液的制備

        毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備:分別精確稱取DON、3-A-DON、15-A-DON、DOM-1、DON-3-葡萄糖苷、T-2毒素、HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇、NEO、T-2四醇四乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于5 mL容量瓶中,用乙腈溶解、定容,制成1.0 mg/mL毒素及衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃條件下避光保存。

        毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備:將毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,分別用超純水稀釋、定容,制成0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg/mL的毒素、毒素衍生物及其混合物的標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃條件下避光保存,使用前拿出置于室溫條件下30 min,每次使用不超過2 h,每10 d更新。

        不同pH值毒素溶液的制備:先將超純水用0.2 mol/L鹽酸溶液和0.2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為3、5、7、9,各取99 mL,在其中加入1 mL 100.0 μg/mL的DON、T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液,制成pH值為3、5、7、9的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液,臨用前制備。

        1.3.2 不同輻照時(shí)間輻照DON和T-2毒素

        將pH值為7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液各取10 mL于25 mL具刻度玻璃燒杯中(杯底直徑為20 mm),放入紫外燈正下方(液面中心與照射方向垂直),紫外燈功率為20 W、紫外燈管距離液面為150 mm(輻照距離)、室溫(25 ℃),分別輻照15、30、45、60 min,處理完后,用超純水定容至10 mL,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)測(cè)定毒素及其衍生物含量,以未處理毒素溶液為對(duì)照。

        1.3.3 不同輻照距離輻照DON和T-2毒素

        將pH值為7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液各取10 mL于25 mL具刻度玻璃燒杯中(杯底直徑為20 mm),放入紫外燈正下方(液面中心與照射方向垂直),紫外燈功率為20 W、紫外燈管距離液面分別為0、150、200、250、300、350 mm(輻照距離),室溫(25 ℃)條件下輻照60 min,處理完后,用超純水定容至10 mL,用HPLC-MS/MS測(cè)定毒素及其衍生物含量,以未處理毒素溶液為對(duì)照。

        1.3.4 不同pH值條件下輻照DON和T-2毒素

        將pH值為3、5、7、9的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液各取10 mL于25 mL具刻度玻璃燒杯中(杯底直徑為20 mm),放入紫外燈正下方(液面中心與照射方向垂直),紫外燈功率為20 W、紫外燈管距離液面為150 mm(輻照距離),室溫(25 ℃)條件下輻照60 min,處理完后,用超純水定容至10 mL,用HPLC-MS/MS測(cè)定毒素及其衍生物含量,以未處理的不同pH值毒素溶液為對(duì)照。

        1.3.5 HPLC-MS/MS測(cè)定DON及其衍生物、T-2毒素及其衍生物含量

        將含有不同質(zhì)量濃度毒素及其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)工作液以及待測(cè)溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液收集到HPLC進(jìn)樣瓶中,于4 ℃條件下保存,最后用HPLC-MS/MS分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液中被測(cè)組分峰面積為縱坐標(biāo),以被測(cè)組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,對(duì)待測(cè)溶液中毒素及其衍生物進(jìn)行定量。按照下式計(jì)算毒素去除率[17-18]。

        1.3.6 HPLC條件

        流動(dòng)相:A(水,含2 mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸);B(甲醇)。梯度洗脫:0~5 min,5% B;5~6 min,5%~95% B;6~11 min,95% B。流速:0.3 mL/min。柱溫:40 ℃。進(jìn)樣量:30 μL。

        1.3.7 質(zhì)譜條件

        表1 DON、T-2毒素及其衍生物的躍遷監(jiān)測(cè)及電噴霧離子源條件Table1 Transitions monitored and ESI source conditions for DON, T-2 toxin and their derivatives

        掃描方式:正離子模式掃描;檢測(cè)模式:多反應(yīng)檢測(cè);氣簾氣壓力:40 psi(氮?dú)猓?;離子源氣體1:60 psi(氮?dú)猓浑x子源氣體2:60 psi(氮?dú)猓?;離子源溫度:650 ℃;界面加熱器:ON;電噴霧電壓:5 500.00 V;碰撞氣壓力:10 psi(氮?dú)猓?;其他條件如表1所示。

        1.4 數(shù)據(jù)處理方法

        HPLC-MS/MS測(cè)定中采用Analyst software 1.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。每次測(cè)定重復(fù)3 次,結(jié)果用±s表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用PASW Statistics 18軟件,差異顯著性分析采用一維方差分析,顯著性水平設(shè)為0.05。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同輻照時(shí)間對(duì)DON和T-2毒素去除效果的影響

        圖1 紫外輻照時(shí)間對(duì)DON、T-2毒素質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on the concentrations of DON and T-2 toxin

        由圖1可知,經(jīng)紫外輻照后,溶液中DON、T-2毒素的質(zhì)量濃度均隨著輻照時(shí)間的延長而不斷下降,這與Murata等[19]的研究結(jié)果是一致的。輻照60 min后,溶液中DON、T-2毒素的質(zhì)量濃度分別為(0.151±0.025)、(0.254±0.027)μg/mL,DON、T-2毒素去除率分別為(84.90±2.52)%、(74.60±2.74)%。

        2.2 不同輻照距離對(duì)DON和T-2毒素去除效果的影響

        圖2 紫外輻照距離對(duì)DON、T-2毒素質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of UV irradiation distance on the concentrations of DON and T-2 toxin

        由圖2可知,在不同距離輻照后,溶液中DON、T-2毒素的質(zhì)量濃度均隨著輻照距離的增加而不斷增加。輻照距離最短時(shí)(150 mm),DON、T-2毒素去除率最高,分別為(84.90±2.52)%、(74.60±2.74)%。輻照距離最長時(shí)(350 mm),DON、T-2毒素去除率最低,分別為(25.40±2.93)%、(1.90±1.37)%,與最短輻照距離(150 mm)時(shí)相比,去除率分別下降了(59.50±0.41)%、(72.70±1.38)%。

        2.3 不同pH值條件下輻照對(duì)DON和T-2毒素去除效果的影響

        圖3 紫外輻照中pH值對(duì)DON質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of DON solution pH on DON concentration under UV irradiation

        由圖3可知,pH值為3、5、7的對(duì)照組溶液中DON質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定;pH值為9的對(duì)照組溶液中DON質(zhì)量濃度降低為(0.935±0.017)μg/mL,DON去除率為(6.50±1.70)%。pH值為3、5、7、9的處理組溶液中DON質(zhì)量濃度分別降低為(0.083±0.021)、(0.114±0.023)、(0.151±0.025)、(0.865±0.028)μg/mL,DON去除率分別為(91.70±2.10)%、(88.60±2.30)%、(84.90±2.52)%、(13.50±2.80)%。其中pH 9的處理組溶液與對(duì)照組溶液相比,DON去除率僅增加(7.00±1.10)%。

        圖4 紫外輻照中pH值對(duì)T-2毒素質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of T-2 toxin solution pH on T-2 toxin concentration under UV irradiation

        由圖4可知,pH值為3、5、7的對(duì)照組溶液中T-2毒素質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定;pH值為9的對(duì)照組溶液中T-2毒素質(zhì)量濃度降低為(0.950±0.016)μg/mL,T-2毒素去除率為(5.00±1.60)%。pH值為3、5、7、9的處理組溶液中T-2毒素質(zhì)量濃度分別降低為(0.130±0.020)、(0.140±0.025)、(0.254±0.027)、(0.935±0.023)μg/mL,T-2毒素去除率分別為(87.00±2.00)%、(86.00±2.50)%、(74.60±2.74)%、(6.50±2.30)%。其中pH 9的處理組溶液與對(duì)照組溶液相比,T-2毒素去除率僅增加(1.50±0.70)%。

        紫外光輻照對(duì)DON和T-2毒素去除效果有差異是因?yàn)槎叻肿咏Y(jié)構(gòu)雖然類似,但結(jié)構(gòu)存在差異。DON分子在C8位含有羰基官能團(tuán),而T-2毒素分子在C8位不含有羰基官能團(tuán)。分子結(jié)構(gòu)的不同使得二者在被紫外光輻照時(shí)穩(wěn)定性表現(xiàn)出差異。

        2.4 紫外光輻照DON和T-2毒素后的產(chǎn)物分析

        在上述經(jīng)過紫外輻照處理DON、T-2毒素溶液中,對(duì)毒素衍生物3-A-DON、15-A-DON、DOM-1、DON-3-葡萄糖苷、HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇、NEO、T-2四醇四乙酸酯進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)輻照后的DON、T-2毒素溶液中均不含有這些毒素衍生物,紫外輻照可能將DON、T-2毒素轉(zhuǎn)化為了新的未知產(chǎn)物。

        2.5 紫外光輻照去除DON和T-2毒素機(jī)理分析

        目前關(guān)于紫外光輻照對(duì)DON和T-2毒素的作用機(jī)理研究報(bào)道不多。Altug等[20]報(bào)道來自低能量源的紫外輻照處理無花果樣品能降解45.7%的黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1),首次提出紫外輻照產(chǎn)生的臭氧(O3)對(duì)AFB1具有降解作用。根據(jù)此報(bào)道推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)中紫外輻照對(duì)DON、T-2毒素去除作用機(jī)理是紫外輻照產(chǎn)生的O3對(duì)DON、T-2毒素的作用。Young等[21-22]研究了O3對(duì)單端孢霉烯族毒素的作用,在O3低濃度水平時(shí),就能觀察到中間產(chǎn)物,基于紫外和MS檢測(cè)得到的數(shù)據(jù),推測(cè)單端孢霉烯族毒素降解開始于O3攻擊單端孢霉烯族毒素分子中雙鍵,在上面加上2 個(gè)原子氧,分子中其他部分沒有發(fā)生改變,如圖5所示。由于各種毒素氧化所需的O3量不同,所以C8位的烯丙基氧化狀態(tài)顯著影響反應(yīng),氧化所需的O3量多少順序?yàn)椋和玖u基(或酯基)>丙烯亞甲基(無氧)。氧化作用也對(duì)pH值敏感,在pH值為4~6時(shí),所有毒素都容易被氧化,在pH值為7~8時(shí),反應(yīng)程度取決于C8位的氧化狀態(tài),pH值為9時(shí),很少反應(yīng)或無反應(yīng),說明堿性條件抑制O3對(duì)毒素的去除作用,這和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。Young等還發(fā)現(xiàn),濕潤的O3(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.97%)對(duì)1 000 μg/g的DON處理1 h,能使其含量降低90%,而同樣條件下,用干燥的O3處理只能使其含量降低70%。使用體積分?jǐn)?shù)為30%的氯氣處理0.5 h能完全去除DON。除此之外,McKenzie等[23]研究發(fā)現(xiàn),在二氫呋喃環(huán)末端含有雙鍵的AFB1、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素M1(AFM1),與不含有雙鍵的AFB2、AFG2、AFG3相比,更容易受到O3和其他氧化劑的攻擊。用O3處理15 s,展青霉素、赭曲霉毒素A (ochratoxin A,OTA)、伏馬菌素B1(fumonisins,F(xiàn)B1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)含量可降低10%。Proctor等[24]用O3在75 ℃條件下處理花生10 min,發(fā)現(xiàn)能減少77%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的AFB1、80%的AFG1、51%的AFB2和AFG2。Inan等[25]分別用33、60 mg/mL 的O3處理AFB160 min,發(fā)現(xiàn)AFB1的減少量分別為80%、93%。

        圖5 單端孢霉烯族毒素分子與臭 氧反應(yīng)的機(jī)理[21]Fig.5 Proposed mechanism for the reaction of ozone with trichothecenes[21]

        3 結(jié) 論

        s實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紫外光輻照對(duì)DON、T-2毒素具有明顯的去除作用。在相同紫外燈功率下,DON、T-2毒素去除效果受到輻照時(shí)間、輻照距離、毒素溶液pH值的影響。DON、T-2毒素的去除率隨著輻照時(shí)間的延長而不斷增加,隨著輻照距離的增加而不斷減小,隨著毒素溶液pH值的增加而不斷減小。因此,在食品和飼料工業(yè)中可考慮將紫外光輻照技術(shù)作為去除單端孢霉烯族毒素的一種加工方法。

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        Removal of Deoxynivalenol and T-2 Toxin by Ultraviolet Irradiation

        ZOU Zhongyi1, HUANG Fei1, LI Hongjun2,*
        (1. Department of Logistics Management, China Maritime Police Academy, Ningbo 315801, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)

        The effects of irradiation time, irradiation distance and pH of toxin solutions on the removal of deoxynivalenol (DON) and T-2 toxin by ultraviolet (UV) irradiation were investigated. The concentration of toxins and their derivatives were analyzed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and quantifi ed by an external standard method. The concentration of DON and T-2 toxin in solutions decreased with increasing irradiation time and decreasing irradiation distance and pH of toxin solutions. The removal rates of DON and T-2 toxin were (84.90 ± 2.52)% and (74.60 ± 2.74)% after UV irradiation for 60 min under the conditions of 7, 1.0 μg/mL, 20 W and 150 mm for toxin solution pH , toxin concentration , UV light power , and irradiation distance, respectively. The solutions containing DON and T-2 toxin did not contain known derivatives of both toxins after UV irradiation. DON and T-2 toxin might be transformed into new unknown products. DON and T-2 toxin were removed obviously by UV irradiation in non-alkaline condition.

        deoxynivalenol (DON); T-2 toxin; ultraviolet irradiation; high performance liquid chromatography-mass spectrometry

        TS201.6

        A

        1002-6630(2015)19-0007-05

        10.7506/spkx1002-6630-201519002

        2015-05-31

        國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2009CB118806);寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A610190);公安海警學(xué)院科研發(fā)展基金項(xiàng)目(2013XYPYZ013)

        鄒忠義(1982-),男,講師,博士,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail:zzy911zzy911@163.com

        *通信作者:李洪軍(1961-),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail:983362225@qq.com

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