王永麗，李　鋒，陳文彬，陳　肖，黃明明，黎良浩，章建浩，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

響應(yīng)面法優(yōu)化植物抗氧化劑降低培根亞硝胺殘留量的工藝

王永麗1，李鋒2，陳文彬1，陳肖1，黃明明1，黎良浩1，章建浩1，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

為探討植物抗氧化劑降低培根中亞硝胺殘留量的最適添加量，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法研究了培根腌制風(fēng)干過程中茶多酚添加量、葡萄籽提取物與亞硝酸鈉添加量對亞硝胺的影響，模擬得到了二次多項式回歸方程的預(yù)測模型。結(jié)果表明植物抗氧化劑能有效降低亞硝胺殘留量，最佳添加量為：茶多酚310mg/kg，葡萄籽提取物420mg/kg，亞硝酸鈉120mg/kg。在此條件下，N-二甲基亞硝胺的殘留量為0.325μg/kg，與模型預(yù)測值0.3395μg/kg吻合良好，說明優(yōu)化出的回歸方程對于生產(chǎn)實際有一定的理論指導(dǎo)意義。

培根，茶多酚，葡萄籽提取物，亞硝胺，響應(yīng)面法

培根是流行于歐美的一種重要腌臘肉制品，在我國也有類似西式培根的腌臘肉產(chǎn)品，主要集中在我國西南地區(qū)。培根在煙熏、發(fā)酵成熟過程中會產(chǎn)生一些強致癌性的N-二甲基亞硝胺（NDMA），攝入體內(nèi)后可誘發(fā)食道癌以及其它消化系統(tǒng)疾病[1-3]。亞硝酸鹽是肉制品生產(chǎn)過程中重要的食品添加劑，它對于肉品的色澤、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味均有積極的影響，同時它還具有防腐作用[4-7]。但是，亞硝酸鈉會和肉中的胺類反應(yīng)產(chǎn)生強致癌物質(zhì)——亞硝胺[8-9]。因此，研究降低腌臘肉制品中亞硝酸鹽、亞硝胺殘留水平的新工藝對于提高腌臘肉的安全水平具有重要意義。茶多酚和葡萄籽提取物作為抗氧化劑應(yīng)用于腌臘肉制品的加工，可以抑制氧化，控制腐敗微生物生長，低濃度茶多酚（500mg/kg）和葡萄籽提取物（＜0.2%）添加量，可以提高產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味及感官品質(zhì)[10-11]。但其對肉制品中亞硝胺抑制效應(yīng)的研究很少，本實驗選擇天然來源的茶多酚和葡萄籽提取物等抗氧化劑為阻斷劑，研究了其對培根中亞硝胺殘留量的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了其在培根加工過程中抑制亞硝胺生成的最佳配比，以期改進腌臘肉制品的生產(chǎn)工藝，提高其安全品質(zhì)，為生產(chǎn)實踐提供一定的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

五花肉南京蘇果超市衛(wèi)崗店；食品級亞硝酸鈉（≥99%） 天津科密歐試劑有限公司；揮發(fā)性N-二甲基亞硝胺（NDMA） 美國Sigma公司；茶多酚（≥98%）、葡萄籽提取物（≥95%） 南京澤朗生物科技有限公司；二氯甲烷、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸等所用其他試劑均為分析純。

JA2203N電子天平上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司；SPX-250C型恒溫恒濕箱上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Allegra 64 R型高速冷凍離心機美國Beckman Coulter公司；IKAT18basic型高速分散機德國IKA公司；Agilent 7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀美國Agilent公司。

1.2實驗方法

1.2.1培根加工及取樣將新鮮五花肉分割成20cm× 15cm×5cm長方塊，在4℃下冷卻24h。然后，從中隨機抽取三塊作為原料對照組進行測定。五花肉塊用2%（g/100g）的食鹽擦涂表面，于4℃、相對濕度85%～90%條件下腌制3d。腌制結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到控溫控濕培養(yǎng)箱中風(fēng)干成熟12d，溫濕度設(shè)置為：起始溫度13℃、升溫速率1.5℃/d；環(huán)境濕度85%，下降速率0.5%/d[12]。實驗結(jié)束后，分別取10g表面和中間部位的肌肉，切碎、混勻，避光真空包裝，-40℃條件下冷藏備用。

1.2.2N-二甲基亞硝胺殘留量的測定

1.2.2.1樣品預(yù)處理準(zhǔn)確稱取切碎并混勻的樣品20.0g，加入適量的無水硫酸鈉混勻，用重蒸二氯甲烷超聲提取3次，每次60mL二氯甲烷15min超聲提取，利用250mL分液漏斗分離有機溶劑相，經(jīng)10g無水硫酸鈉過濾脫水后，收集到平底燒瓶，在50℃水浴下抽真空濃縮至10mL左右，再用氮吹儀濃縮近干，用色譜甲醇定容至1.0mL，過0.45μm微孔濾膜，上機測定[13]。

1.2.2.2GC-MS儀器條件色譜柱為HP-5MS毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm），進樣口溫度：230℃，不分流進樣；采用程序升溫：初始溫度50℃，保持2min，以8℃/min升至150℃，保持5min，然后以20℃/min升至250℃，保持2min；載氣為高純氦氣（99.999%），流速1mL/min；電子轟擊（EI）離子源；電子倍增器電壓1301ev；電離電壓70ev；離子源和四極桿溫度分別為230℃和250℃；測定采用SIM/全掃描（SCAN）采集模式，掃描質(zhì)量范圍：30～150m/z，溶劑延遲時間2.5min，進樣量為1μL。采用外標(biāo)法進行N-二甲基亞硝胺定量計算。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1茶多酚添加量對揮發(fā)性N-二甲基亞硝胺殘留量影響研究五花肉上鹽階段，固定葡萄籽提取物的添加量為400mg/kg，亞硝酸鈉的添加量為120mg/kg，然后按照茶多酚0、100、200、300、400、500mg/kg不同的濃度添加，將腌制劑及抗氧化劑均勻涂抹在五花肉表面，腌制及風(fēng)干操作同1.2.1。

1.2.3.2葡萄籽提取物添加量對揮發(fā)性N-二甲基亞硝胺殘留量影響研究五花肉上鹽階段，固定茶多酚的添加量為300mg/kg，亞硝酸鈉的添加量為120mg/kg，然后按照葡萄籽提取物0、200、300、400、500、600mg/kg不同的濃度添加，將腌制劑及抗氧化劑均勻涂抹在五花肉表面，腌制及風(fēng)干操作同1.2.1。

1.2.3.3亞硝酸鈉添加量對揮發(fā)性N-二甲基亞硝胺殘留量影響研究五花肉上鹽階段，固定茶多酚的添加量為300mg/kg，葡萄籽提取物的添加量為400mg/kg，然后按照亞硝酸鈉0、60、90、120、150、180mg/kg不同的濃度添加，將腌制劑及抗氧化劑均勻涂抹在五花肉表面，腌制及風(fēng)干操作同1.2.1。

1.2.4響應(yīng)面實驗方法在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以茶多酚、葡萄籽提取物、亞硝酸鈉添加量為因子，以N-二甲基亞硝胺殘留量為評價指標(biāo)進行響應(yīng)面優(yōu)化分析。實驗因素水平見表1。

表1　響應(yīng)面實驗設(shè)計因素及水平Table.1　Variables and their levels used in response surface experiment

1.2.5數(shù)據(jù)分析響應(yīng)面實驗結(jié)果利用最小二乘法進行二次多項式回歸統(tǒng)計分析，其基本模型如下：

Y=β0+∑βiXi+∑βiiXii2+∑∑βijXiXj

式中：β0，βi，βii和βij是回歸系數(shù)；Xi和Xj代表不同的自變量；Y代表響應(yīng)變量。

圖1　茶多酚添加量對N-二甲基亞硝胺殘留量的影響Fig.1　Effect of tea polyphenols addition on NDMA residue in bacons

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果及分析

2.1.1茶多酚添加量對揮發(fā)性N-二甲基亞硝胺殘留量的影響由圖1可以看出，與對照相比，在腌制階段添加茶多酚可以有效降低NDMA殘留量，并且隨著其添加量的增加，NDMA逐漸降低；當(dāng)茶多酚添加量為300mg/kg時，NDMA殘留量最低，為0.36μg/kg，比對照組下降了37.09%；而后NDMA值趨于穩(wěn)定。這可能是由于茶多酚富含酚羥基，可以解離出H+，H+能與亞硝酸反應(yīng)，消耗亞硝酸根，而亞硝酸根是亞硝胺的前體物質(zhì)，從而降低了NDMA的形成[14-15]，故選擇茶多酚添加量為300mg/kg。

2.1.2葡萄籽提取物添加量對揮發(fā)性N-二甲基亞硝胺殘留量的影響由圖2可見，在腌制階段加入葡萄籽提取物后，NDMA殘留量不斷降低；當(dāng)葡萄籽提取物添加量為400mg/kg時，培根中NDMA含量最低，為0.37μg/kg，然后趨向穩(wěn)定。葡萄籽提取物是酚類化合物，能釋放其羥基上的活潑氫，捕獲自由基，阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成一氧化氮，阻斷亞硝胺生成。而且，葡萄籽提取物有強抑菌效果，可與蛋白質(zhì)之間的多位點結(jié)合抑制微生物生長，防止微生物降解蛋白質(zhì)為胺類物質(zhì)和氨基酸[16-17]。故選擇葡萄籽提取物添加量為400mg/kg。

圖2　葡萄籽提取物添加量對N-二甲基亞硝胺殘留量的影響Fig.2　Effect of grape seed extracts addition on NDMA residue in bacons

2.1.3亞硝酸鈉添加量對揮發(fā)性N-二甲基亞硝胺殘留量的影響由圖3可以看出，亞硝酸鈉添加量在60～120mg/kg時，NDMA殘留量緩慢增加；當(dāng)亞硝酸鈉添加量大于120mg/kg時，NDMA殘留量呈現(xiàn)快速增加趨勢。這可能是在低亞硝酸鈉添加量時，茶多酚和葡萄籽提取物作為強還原劑，可使亞硝酸、亞硝酸鹽或三氧化二氮還原為一氧化氮，阻斷亞硝胺的生成[18]；當(dāng)亞硝酸鈉添加量大于120mg/kg時，亞硝酸鹽處于過飽和狀態(tài)，而與亞硝胺的另一前體物質(zhì)生物胺反應(yīng)生成NDMA[19]。

圖3　添加亞硝酸鈉對N-二甲基亞硝胺殘留量的影響Fig.3　Effect of sodium nitrite addition on NDMA residue in bacons

2.2響應(yīng)面實驗結(jié)果及分析

2.2.1回歸模型建立及顯著性分析根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，綜合分析單因素實驗結(jié)果，選取對NDMA殘留量影響顯著的茶多酚添加量、葡萄籽提取物添加量和亞硝酸鈉添加量，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面分析實驗，實驗結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table.2　Experiment design and results of response surface analysis

該實驗共包括17個實驗點，可分為兩類：一類是析因點，為自變量取值所構(gòu)成的三維頂點，共包括12個實驗點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)5次，用以估計實驗誤差。以NDMA殘留量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 6.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到NDMA對自變量的多元回歸方程為：Y=4.76288-0.00444×A-0.00625875× B-0.040096×C-1.60E-006×AB+1.16667E-006×AC+ 2.58333E-006×BC+8.01250E-006×A2+7.68750E-006×B2+1.59861E-004×C2。

由表3方差分析結(jié)果可以看出，上述回歸模型極顯著（p＜0.0001），失擬性不顯著（p=0.6329＞0.05），方程的決定系數(shù)（R2）和校正決定系數(shù)（R2adj）分別為0.99和0.98，說明該模型能解釋98%響應(yīng)值的變化，該模型的擬合度高，實驗誤差小，能夠用于分析茶多酚、葡萄籽提取物以及亞硝酸鈉對NDMA的交互作用及對NDMA殘留量進行預(yù)測。

各因素的顯著性檢驗表明：一次項中B對于響應(yīng)值的影響極顯著（p＜0.001），A和C對響應(yīng)值的影響顯著（p＜0.05），而所有的二次項對NDMA殘留量的影響均極顯著（p＜0.0001）；交互項中，茶多酚與葡萄籽提取物的交互作用（AB）對NDMA殘留量影響顯著（p＜0.05），其余交互項影響不顯著。這些結(jié)果表明，在干腌培根加工過程中，茶多酚和葡萄籽提取物的添加量對NDMA有著非常重要的抑制作用[18]，它們的影響是非線性的。由于在實際加工過程中，各個因素往往同時起作用，因此研究它們的交互作用對抑制生產(chǎn)過程中NDMA的生成具有重要意義。

表3　回歸模型方差分析表Table.3　Analysis of variance of regression equation

2.2.2茶多酚和葡萄籽提取物添加量對NDMA的交互作用通過回歸模型繪制響應(yīng)面是評價兩因素對響應(yīng)變量交互作用最常用的方法，通過它們的形狀可以反映出兩實驗因素之間的交互作用是否顯著，比如曲率比較大的橢圓形曲面表示兩因素的交互作用顯著，而曲率小的則相反[20]。

圖4是固定亞硝酸鈉添加量為120mg/kg，茶多酚和葡萄籽提取物添加量對NDMA殘留量的響應(yīng)面。響應(yīng)面的形狀反映了因素對變量的交互作用，曲率越大，表明交互作用越顯著，反之越弱。從圖4中可以看出，茶多酚和葡萄籽提取物添加量對NDMA殘留量具有明顯的交互作用，影響NDMA殘留量的葡萄籽提取物臨界值隨著培根腌制過程中茶多酚濃度的增加而增加。當(dāng)茶多酚添加量為200mg/kg時，該臨界值約為403.9mg/kg；當(dāng)茶多酚濃度增加到300mg/kg時，臨界值增加到418.1mg/kg。

圖4　茶多酚和葡萄籽提取物對NDMA殘留量交互作用的響應(yīng)面圖Fig.4　The response surface of the addition of tea polyphenols and grape seed extracts on NDMA content

不同茶多酚添加量對葡萄籽提取物臨界值的影響結(jié)果見表4。將表4中的葡萄籽提取物濃度臨界值對茶多酚添加量進行線性回歸分析，可以看出葡萄籽提取物濃度對NDMA殘留量影響的臨界值隨著茶多酚添加量的增大呈線性增加（y=0.1051x+385.71，R2=0.989）。NDMA殘留量隨茶多酚添加量的增加呈線性下降，當(dāng)茶多酚添加量為300mg/kg時，NDMA值為0.340μg/kg，這表明茶多酚和葡萄籽提取物對NDMA殘留量的清除效果顯著，并且協(xié)同效果比單一抗氧化劑好。

表4　不同茶多酚添加量條件下葡萄籽提取物對NDMA殘留量影響的濃度臨界值Table.4　The critical values of grape seed extract upon the addition of different levels of tea polyphenol

表5　不同葡萄籽提取物添加量條件下茶多酚對NDMA殘留量影響的濃度臨界值Table.5　The critical values of tea polyphenol upon the addition of different levels of grape seed extract

對于茶多酚添加量的臨界值，當(dāng)葡萄籽提取物的添加量在0～400mg/kg時，呈現(xiàn)增加的趨勢，而NDMA殘留量降低，說明在培根的加工過程中，茶多酚與葡萄籽提取物協(xié)同抑制NDMA的生成。具體關(guān)于葡萄籽提取物添加量對于茶多酚的添加量臨界值及NDMA殘留量的影響結(jié)果見表5。當(dāng)葡萄籽提取物添加量大于400mg/kg時，NDMA殘留量開始升高。因此葡萄籽提取物的添加濃度應(yīng)小于500mg/kg，考慮到培根產(chǎn)品的感官品質(zhì)，以400mg/kg為響應(yīng)面的中心濃度合適。

由表5可知，當(dāng)葡萄籽添加濃度為400mg/kg時，茶多酚的臨界值為308.3mg/kg，這與單因素實驗結(jié)果基本一致。葡萄籽提取物對茶多酚濃度臨界值進行線性回歸分析的結(jié)果（y=0.1x+268.3，R2=1），表明茶多酚影響NDMA殘留量的臨界濃度隨著葡萄籽提取物濃度的升高呈上升趨勢。

2.3驗證實驗

為降低培根中的NDMA殘留量，由響應(yīng)面實驗得到的抗氧化劑最佳添加量為：茶多酚310.10mg/kg，葡萄籽提取物419.03mg/kg，亞硝酸鈉120.88mg/kg，在此工藝下，培根中NDMA殘留量預(yù)測值為0.3395μg/kg。考慮到實際情況，校正最優(yōu)添加量為：葡萄籽提取物420mg/kg，茶多酚310mg/kg，亞硝酸鈉120mg/kg。在此條件下，做3次平行實驗，檢測培根中NDMA殘留量為0.325μg/kg，與預(yù)測值相比誤差為0.04%，這表明該模型的預(yù)測效果良好，響應(yīng)面模型優(yōu)化實驗結(jié)果可靠。

3　結(jié)論

研究了茶多酚、葡萄籽提取物和亞硝酸鹽添加量抑制培根中NDMA殘留量的影響，并采用響應(yīng)面法對培根腌制加工工藝進行優(yōu)化，通過回歸分析建立了NDMA的二次多項式預(yù)測模型。由回歸方程得到的最佳抗氧化劑添加量為：茶多酚310mg/kg，葡萄籽提取物420mg/kg，亞硝酸鈉120mg/kg，在此條件下NDMA實測值為0.325μg/kg，與預(yù)測值吻合良好，說明該模型能很好地預(yù)測培根的NDMA殘留量。

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Optimization of process of reducing N-nitrosamines content in bacons using plant antioxidants by response surface methodology

WANG Yong-li1，LI Feng2，CHEN Wen-bin1，CHEN Xiao1，HUANG Ming-ming1，LI Liang-hao1，ZHANG Jianhao1，*
（1.National Central of Meat Quality and Safety Control，College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China）

In order to obtain the optimum addition of plant antioxidants to reduce the N-nitrosamines content in bacons，three key factors including tea polyphenols concentration，grape seed extract dose and sodium nitrite levels were optimized using the Box-Behnken response surface methodology based on single-factor experiment. Results showed that plant antioxidants could effectively reduce N-nitrosamines residues，and the optimum addition of plant antioxidants were as follows：tea polyphenol 310mg/kg，grape seed extract 420mg/kg and sodium nitrite 120mg/kg.Under these conditions，N-nitrosodimethylamine（NDMA）residue was 0.325μg/kg，which was close to the theoretical values of 0.3395μg/kg.These findings indicated that the optimized regression equation was of theoretical significance to guide the actual production.

bacons；tea polyphenols；grape seed extract；N-nitrosamines；response surface methodology

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0296-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.056

2014－05－21

王永麗（1983-），女，博士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。

章建浩（1961-），男，博士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B01）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303082-2）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31201417）；中國博士后科學(xué)基金（2013M540561）。