王　勃，趙　旭，馬　濤，*，劉　賀，何余堂，惠麗娟

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州121013；2.遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧沈陽(yáng)110866）

響應(yīng)面法優(yōu)化脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅表皮霉菌的殺菌工藝

王勃1，趙旭2，馬濤1，*，劉賀1，何余堂1，惠麗娟1

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州121013；2.遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧沈陽(yáng)110866）

采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅表面殺菌的工藝參數(shù)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取閃照次數(shù)、閃照距離、閃照能量為因素，霉菌殺菌率為指標(biāo)，通過響應(yīng)面優(yōu)化模型確定脈沖強(qiáng)光殺菌的最佳條件為：閃照次數(shù)為34次、閃照距離為10cm、閃照能量為400J，此條件下脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅表面霉菌殺菌率可達(dá)到99.85%。采用上述分析的最佳殺菌條件處理的月餅，在國(guó)標(biāo)規(guī)定的霉菌數(shù)量范圍內(nèi)，其貨架期比空白樣品延長(zhǎng)了30d，并且其酸價(jià)和過氧化值都符合國(guó)標(biāo)規(guī)定，說明脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅油脂穩(wěn)定性沒有顯著影響，不會(huì)影響月餅品質(zhì)。

脈沖強(qiáng)光，月餅，霉菌，殺菌率，貨架期

月餅含有豐富的油脂和糖分，受熱受潮都易發(fā)霉、變質(zhì)。中秋節(jié)前夕，月餅的市場(chǎng)需求量集中加大，月餅廠商需趕制大批量月餅。以上種種因素使得月餅需要提前一個(gè)月甚至更久就生產(chǎn)出來，這其中的制作過程如果殺菌不徹底及包裝貯藏不當(dāng)，都會(huì)造成微生物的超標(biāo)，尤其是烘烤熟制的月餅在冷卻、包裝過程中更容易受到環(huán)境、人為等的二次污染，影響月餅的食用安全，縮短貨架期。

脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)是近些年來出現(xiàn)的一種非熱殺菌新技術(shù)，它利用瞬時(shí)、高強(qiáng)度的脈沖能量殺滅食品和包裝上各類微生物，有效的保持食品質(zhì)量，延長(zhǎng)食品貨架期[1]。該技術(shù)由于只處理食品的表面，從而對(duì)食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分影響很小，可用于延長(zhǎng)以透明物料包裝的食品及新鮮食品的貨架期[2]。脈沖強(qiáng)光主要涉及糧油制品、果蔬制品、水產(chǎn)制品等食品殺菌保藏方面[3-7]，在焙烤制品上的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本文研究了脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅表皮霉菌殺菌的效果，為延長(zhǎng)月餅貨架期應(yīng)用脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

月餅實(shí)驗(yàn)室自制；月餅皮配料為53%的面粉，15%豆油，31%糖漿，1%枧水；月餅餡購(gòu)自青島匯豐苑食品公司；冰乙酸、碘化鉀、酚酞天津市北辰方正試劑有限公司；可溶性淀粉天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；孟加拉紅培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（Na2S2O3）＝1.000mol/L]、氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（KOH）＝1.000mol/L] 上海晶純生化科技股份有限公司；三氯甲烷、乙醚錦州古城化學(xué)試劑廠；石油醚、乙醇天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

AR224CN電子天平豪斯儀器（上海）有限公司制造；BPS-100CA恒溫恒濕培養(yǎng)箱、DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱、LRH-150生化培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋上海一恒儀器科學(xué)有限公司；EC2菌落計(jì)數(shù)儀法國(guó)梅里埃生物公司；GMSX-280壓力蒸汽滅菌器北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；MiniMix 400W拍打均質(zhì)器法國(guó)Interscience公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣凈化有限公司；TDZ4-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；ZWB-I-01（LA50-800H）脈沖強(qiáng)光殺菌器寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1月餅制作工藝

豆油、糖漿、枧水

↓機(jī)械攪拌

月餅粉配制→混合→醒發(fā)→包餡→壓模→烘烤→冷卻→包裝→成品月餅

1.2.2樣品的處理實(shí)驗(yàn)室自制月餅重量為100.0g，其中月餅皮45.0g，月餅餡55.0g。焙烤好的月餅在焙烤完成之后要迅速移至無(wú)菌室內(nèi)，待月餅表皮溫度降至常溫后再進(jìn)行包裝，這樣的操作使月餅在包裝環(huán)節(jié)中盡可能減少被雜菌污染的概率，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀準(zhǔn)確性[8]。無(wú)菌操作條件下，從包裝袋中取出月餅放置于無(wú)菌的石英板上，通過調(diào)整石英板的高低來實(shí)現(xiàn)樣品與脈沖氙燈之間的距離，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果更改操作界面上的脈沖次數(shù)和脈沖能量，閃照頻次為2次/s。閃照后將月餅皮餡分離，取遠(yuǎn)離月餅餡的餅皮25.0g，放入盛有225mL無(wú)菌水的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2min，制成1∶10的樣品勻液，搖勻液進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。取同等質(zhì)量的月餅餅皮不做任何處理，培養(yǎng)5d后得到的活菌數(shù)即為月餅餅皮樣本的原始菌落數(shù)。

1.2.3霉菌的檢測(cè)參照國(guó)標(biāo)GB 4789.15-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)[9]。

脈沖強(qiáng)光的殺菌效果依據(jù)微生物的殺菌率來評(píng)價(jià)，殺菌率的計(jì)算公式如下：

式中：A0：原始菌落數(shù)，A：處理后的菌落數(shù)。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)固定閃照距離為10cm，閃照能量為300J，研究閃照次數(shù)為20、25、30、35、40次對(duì)月餅殺菌效果的影響；固定閃照次數(shù)為30次，閃照能量為300J，研究閃照距離為9、10、11、12、13cm對(duì)月餅殺菌效果的影響；固定閃照次數(shù)30次，閃照距離10cm，研究閃照能量100、200、300、400、500J對(duì)月餅殺菌效果的影響。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅表面殺菌效果的影響以霉菌的殺菌率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化脈沖強(qiáng)光殺菌工藝條件[10-12]。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理[13]，通過Design Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)脈沖強(qiáng)光殺菌的最佳工藝條件。各因素及水平編碼如表1所示。

表1　響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表Table.1　Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in the response surface analysis

1.2.6月餅貨架期的微生物指標(biāo)測(cè)定無(wú)菌操作條件下，選取50個(gè)外觀良好的月餅對(duì)其進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理，設(shè)定殺菌參數(shù)為上述響應(yīng)面分析出的最佳殺菌條件。再選取另50個(gè)月餅不做任何處理，一同放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每天選取一個(gè)經(jīng)過脈沖強(qiáng)光處理的月餅和一個(gè)未做處理的月餅作為對(duì)照，直到樣品霉菌數(shù)超過國(guó)標(biāo)規(guī)定值，無(wú)需再測(cè)定。霉菌數(shù)的檢測(cè)方法按照參照國(guó)標(biāo)GB 4789.15-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)。每種樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.7月餅貨架期的理化指標(biāo)測(cè)定

1.2.7.1酸價(jià)的測(cè)定稱取20.0g月餅餅皮于研缽中磨碎，置于錐形瓶中，石油醚浸泡過夜后離心取上清液倒入三角瓶中，45℃水浴揮去石油醚，放置干燥箱中1min烘干瓶身水分，得到所需油脂[14]。

稱取3.0g混勻的油脂樣品，置于錐形瓶中，加入50mL中性乙醚-乙醇（2＋1）混合液，放置于恒溫振蕩器（參數(shù)設(shè)定為：40℃，5min）使油脂溶解。取出后冷卻至室溫，加入酚酞指示液2～3滴，以氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（1.000mol/L）滴定，至出現(xiàn)微紅色且半分鐘內(nèi)不褪色為指示終點(diǎn)。每次測(cè)定做3次平行實(shí)驗(yàn)。

酸價(jià)的測(cè)定原理以及計(jì)算公式均參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.37-2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[15]。

1.2.7.2過氧化值的測(cè)定油脂樣品的提取參照上述酸價(jià)測(cè)定的方法進(jìn)行，過氧化值的測(cè)定原理以及計(jì)算公式均參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.37-2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1閃照次數(shù)對(duì)殺菌率的影響由圖1可以看出，在閃照次數(shù)為25～35次時(shí)，殺菌率提升的較為明顯，在35～40次時(shí)，殺菌率提高趨緩。隨著脈沖強(qiáng)光照射次數(shù)的增加，平板上的菌落數(shù)逐漸減少[16]。當(dāng)閃照次數(shù)為35次時(shí)，其殺菌率為99.55%，所殘留的微生物菌落數(shù)符合國(guó)標(biāo)規(guī)定。鑒于節(jié)約殺菌成本并綜合考慮兩評(píng)價(jià)指標(biāo)的最佳閃照次數(shù)，選取25、30、35次繼續(xù)對(duì)月餅的殺菌效果做響應(yīng)面分析以確定最佳的閃照次數(shù)。

圖1　閃照次數(shù)對(duì)殺菌效果的影響Fig.1　Effect of flash time on sterilization rate

2.1.2閃照距離對(duì)殺菌率的影響由圖2可以看出，隨著閃照距離的增大，殺菌率呈減少趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著脈沖強(qiáng)光與月餅的距離越遠(yuǎn)，脈沖強(qiáng)光的能量越弱，殺菌效果也越差。綜合考慮兩評(píng)價(jià)指標(biāo)的最佳閃照距離，選取9、10、11cm繼續(xù)對(duì)月餅的殺菌效果做響應(yīng)面分析以確定最佳的閃照距離。

圖2　閃照距離對(duì)殺菌效果的影響Fig.2　Effect of flash distance on sterilization rate

2.1.3閃照能量對(duì)殺菌率的影響由圖3可以看出，隨著閃照能量的增加，殺菌率呈增加趨勢(shì)。在閃照能量為100～300J時(shí)，殺菌率明顯提高，而在400～500J時(shí)，殺菌效果提升的并不明顯。脈沖強(qiáng)光處理對(duì)細(xì)胞膜造成了嚴(yán)重?fù)p傷并大幅降低了胞內(nèi)酶的活性，這也可能是霉菌致死的主要原因之一[17]。綜合考慮兩評(píng)價(jià)指標(biāo)的最佳閃照能量，選取200、300、400J繼續(xù)對(duì)月餅的殺菌效果做響應(yīng)面分析以確定最佳的閃照能量。

圖3　閃照能量對(duì)殺菌效果的影響Fig.3　Effect of flash energy on sterilization rate

2.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓帮@著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以閃照次數(shù)、閃照距離、閃照能量為因素，以微生物殺菌率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行三因素三水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)（包括5個(gè)零點(diǎn)）的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table.2　Box-Behnken experimental design arrangement and corresponding results

根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸擬合，得到以殺菌率（Y）為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程模型為：

Y＝96.95＋3.75X1－0.91X2＋2.56X3＋0.59X1X2－ 1.24X1X3－0.58X2X3－0.81X12－0.33X22－1.51X32

對(duì)該數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)?；貧w模型進(jìn)行方差分析及可信度分析結(jié)果見表3。

根據(jù)α=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的回歸方程為：

Y＝96.95＋3.75X1－0.91X2＋2.56X3＋0.59X1X2－ 1.24X1X3－0.58X2X3－0.81X12－1.51X32

根據(jù)表3可知，模型p＜0.0001，表示模型是極顯著的，證明模型成立，本實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。失擬項(xiàng)不顯著（p=0.8609＞0.05），表明回歸方程無(wú)失擬因素存在，回歸方程擬合較好。進(jìn)一步解釋驗(yàn)證在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)可以用來解釋和預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一次項(xiàng)系數(shù)X1、X2、X3的系數(shù)都是極顯著（p＜0.0001），說明閃照次數(shù)、閃照距離及閃照能量對(duì)脈沖強(qiáng)光的殺菌率影響有顯著作用。交互項(xiàng)X1X2（p=0.0069＜0.01），交互項(xiàng)X2X3（p=0.0075＜0.01），交互項(xiàng)X1X3（p＜0.0001）的交互作用對(duì)殺菌率的影響極顯著。綜上所述，影響因素的主次順序?yàn)椋篨1（閃照次數(shù)）＞X3（閃照能量）＞X2（閃照距離）。模型的校正決定系數(shù)（Adj R-Square）為0.9920，說明該模型能解釋99.20%的響應(yīng)值的變化，該方程與實(shí)際擬合的較好，能有效反應(yīng)脈沖強(qiáng)光殺菌率與閃照次數(shù)、閃照距離和閃照能量之間的關(guān)系，因此所得的方程能預(yù)測(cè)響應(yīng)值隨各參數(shù)的變化規(guī)律[18-19]。

表3　響應(yīng)面方差分析Table.3　Analysis of variance for the fitted mathematical model

2.3響應(yīng)面因素水平的優(yōu)化及驗(yàn)證

將任一個(gè)因素固定在建立好的回歸模型的零水平上，其余交互的兩因素的結(jié)果也將由此得出，二次回歸方程的3D響應(yīng)面圖見圖4～圖6。下圖可反映出脈沖強(qiáng)光殺菌率在各因素的中心點(diǎn)附近可獲得最大值。

根據(jù)編碼公式求出自變量X1、X2、X3的編碼值為X1=0.915，X2=－0.127，X3=0.712，對(duì)應(yīng)的真實(shí)值為：X1= 33.77，X2=9.82，X3=377.45，即閃照次數(shù)為33.77次，閃照距離為9.82cm，閃照能量為377.45J，此時(shí)預(yù)測(cè)的殺菌率可達(dá)到99.8221%。

圖4　閃照次數(shù)、閃照距離及其交互作用的3D響應(yīng)面Fig.4　3D response surface plot showing the effects of flash time，flash distance and their mutual interactions

圖5　閃照次數(shù)、閃照能量及其交互作用的3D響應(yīng)面Fig.5　3D response surface plot showing the effects of flash time，flash energy and their mutual interactions

圖6　閃照距離、閃照能量及其交互作用的3D響應(yīng)面Fig.6　3D response surface plot showing the effects of flash distance，flash energy and their mutual interactions

為檢驗(yàn)響應(yīng)面的可靠性，在最佳殺菌條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考率到實(shí)際操作，將最佳條件修正為：閃照次數(shù)為34次、閃照距離為10cm、閃照能量為400J，此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，脈沖強(qiáng)光殺菌率為99.85%，與預(yù)測(cè)值相接近，說明回歸方程能夠較為直觀地反映和模擬各因素對(duì)脈沖強(qiáng)光殺菌率的影響，結(jié)果表明該模型是合理有效的，在實(shí)際情況中具有一定的指導(dǎo)意義。

2.4貨架期的理化及微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)《GB 7099-2003糕點(diǎn)、面包衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，熱加工糕點(diǎn)和面包的霉菌指標(biāo)是≤100cfu/g，冷加工是≤150cfu/g[20]。酸價(jià)（以脂肪計(jì)）≤5mg KOH/g，過氧化值（以脂肪計(jì)）≤0.25g/100g。

表4　脈沖強(qiáng)光殺菌對(duì)月餅微生物和理化指標(biāo)的影響Table.4　Effect of intense pulsed light does on the microorganism and physicochemical indexes of moon cake

由表4可知，未做處理的月餅在第20d的時(shí)候，霉菌數(shù)量已經(jīng)超過國(guó)標(biāo)規(guī)定的100cfu/g，而經(jīng)過脈沖強(qiáng)光殺菌后的月餅在第50d的時(shí)候，霉菌數(shù)量才超過國(guó)標(biāo)規(guī)定，比未做處理的月餅貨架期延長(zhǎng)了30d。這說明月餅經(jīng)過脈沖強(qiáng)光殺菌能夠延長(zhǎng)其貨架期，并且微生物霉菌數(shù)量在貨架期延長(zhǎng)期內(nèi)都符合國(guó)標(biāo)要求。理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)過脈沖強(qiáng)光殺菌后的月餅在50d內(nèi)的酸價(jià)和過氧化值均符合國(guó)標(biāo)規(guī)定。以上結(jié)果表明，脈沖強(qiáng)光殺菌能夠在符合國(guó)標(biāo)規(guī)定的情況下有效地延長(zhǎng)月餅的貨架期。

3　結(jié)論

采用脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)可以有效殺滅月餅表面污染的霉菌，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)脈沖強(qiáng)光在月餅的殺菌條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了閃照次數(shù)、閃照距離、閃照能量3個(gè)因素對(duì)殺菌率的二次回歸方程模型。最佳條件為：閃照次數(shù)為34次、閃照距離為10cm、閃照能量為400J，此條件下脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅表面霉菌殺菌率可達(dá)到99.85%。

采用響應(yīng)面法分析出的脈沖強(qiáng)光殺菌最佳條件，在國(guó)標(biāo)規(guī)定的霉菌數(shù)量范圍內(nèi)，經(jīng)過脈沖強(qiáng)光處理的月餅比未作處理的月餅貨架期延長(zhǎng)了30d，并且其酸價(jià)和過氧化值都符合國(guó)標(biāo)規(guī)定，證明脈沖強(qiáng)光處理在貨架期內(nèi)對(duì)月餅油脂穩(wěn)定性沒有顯著影響，不會(huì)影響月餅品質(zhì)。

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Sterilizing effect of pulsed light on the mould which is on the moon cake surface

WANG Bo1，ZHAO Xu2，MA Tao1，*，LIU He1，HE Yu-tang1，HUI Li-juan1
（1.College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Grain and Oil Science and Technology Institute of Bohai University，Jinzhou 121013，China；2.Grain Science Research Institute of Liaoning Province，Shenyang 110866，China）

The pulsed light sterilizing parameters for moon cake surface were optimized by RSM.The impacts of flash times，flash distance and flash energy，sterilization rate were investigated.Results showed that optimal sterilizing conditions were flash times of 34，flash distance of 10cm，flash energy of 400J.Under the optimized conditions，bacteria sterilization rate could reach to be 99.85%.The best sterilizing conditions were optimized by using RSM.In the number range of mold in National Standard，it could be extended 30 days than blank sample.The acid value and the peroxide value were in accordance with the National Standard.The pulsed light had no significant effect on the oil stability and quality of mooncake.

pulsed light；moon cake；moulds；sterilization rate；shelf life

TS201.3

B

1002-0306（2015）04-0255-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.047

2014－05－26

王勃（1986-），男，碩士，實(shí)驗(yàn)員，研究方向：糧油科學(xué)。

馬濤（1962-），男，博士，教授，研究方向：糧油科學(xué)。