金亞香，孫　晶，李洪軍

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033）

大葉苦丁茶抗氧化成分的提取及活性的比較研究

金亞香，孫晶，李洪軍*

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033）

大葉苦丁茶是一種傳統(tǒng)的食藥兩用茶飲品，含有多種活性成分，為了提高大葉苦丁茶的利用效率，采用85%乙醇提取，并依次分別用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行液-液萃取，分別得到石油醚組分（PS）、乙酸乙酯組分（PA）、氯仿組分（PC）、正丁醇組分（PB），和剩余的水溶性部分（PW）。隨后采用化學(xué)方法對(duì)各組分進(jìn)行定性和定量鑒定，并研究了各組分體外對(duì)DPPH自由基的清除作用，和體內(nèi)對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠血清中SOD和MDA的影響。結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取組分主要為酚類和黃酮類，氯仿萃取組分中主要為蛋白質(zhì)和生物堿類，正丁醇萃取組分主要為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，而水相主要含有蛋白質(zhì)和糖類。PA對(duì)DPPH自由基清除作用最好，當(dāng)其濃度為100mg/mL時(shí)，最高清除率可達(dá)到50%。其次是PW、PC和PB。此外體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)表明PA和PW能夠顯著提高小鼠血清中SOD活性，降低MDA產(chǎn)量，與陽(yáng)性對(duì)照組治療效果接近，與模型組有顯著差異。

大葉苦丁茶，抗氧化活性，分級(jí)萃取

大葉苦丁茶（Ilex Kudingcha C.J.Tsing），又名富丁茶，原植物來(lái)源為大葉冬青及苦丁茶冬青，為冬青科常綠喬木。因其生長(zhǎng)于山巒溪澗之間，且沖泡后具有先苦后甘的口感而得名[1]。它既可以作為飲品，又具有神奇的藥用價(jià)值。早在明代李時(shí)珍所著《本草綱目》中便有記載其主治：煮飲，止渴、明目、除煩，令人不唾，消痰利水[2]。大葉苦丁茶中的主要化學(xué)成分包括黃酮類、多酚類、三萜類、有機(jī)酸、氨基酸類和多種微量元素、維生素類[3-4]等。這些活性成分單獨(dú)、或是聯(lián)合發(fā)揮多種藥理活性，包括清涼解毒、降脂、降壓、抑菌、抗氧化、減肥等功效[5-6]。研究表明，從大葉冬青苦丁茶中分離的多酚、多糖、生物堿、黃酮類生物分子都具有明顯的抗氧化性能，尤其是黃酮類和多酚類可以在食物油中溶解，所以可以被用作油脂、食品等的抗氧化劑[7]。食用后，也可以延緩衰老，清除體內(nèi)的自由基。然而大葉苦丁茶中的主要活性成分極性等差異較大，所以采用單一溶劑提取效率不高，利用有機(jī)溶劑分級(jí)萃取植物中不同極性組分的方法已被應(yīng)用于玉竹降糖組分的提取中，這種方法簡(jiǎn)單、快速，能夠提高植物的利用率[8]。所以本文亦采用有機(jī)溶劑對(duì)大葉苦丁茶粗提物進(jìn)行分級(jí)萃取，并分別對(duì)各種提取物體內(nèi)和體外的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)大葉苦丁茶的綜合開(kāi)發(fā)利用有一定意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大葉苦丁茶原料產(chǎn)自浙江紹興的大葉冬青苦丁茶；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，合格證號(hào)為SCXK-（吉）2010-0003，由長(zhǎng)春生物制品研究所提供；DPPH、碘化鉍鉀試劑、雙縮脲試劑、茚三酮試劑、香草醛-硫酸試劑等購(gòu)自北京化工廠；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

DHP-908型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒儀器有限公司；UV-3150型紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大葉苦丁茶主要成分的提取準(zhǔn)確稱取100g干燥的大葉苦丁茶，用小型機(jī)械粉碎機(jī)粉碎、研缽研磨后過(guò)60目篩，提取工藝為：85%乙醇∶茶（v/w）為10∶1，回流提取2次，合并濾液，減壓濃縮，蒸干得粗提物。然后該提取物用100mL蒸餾水重懸，并依次分別用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行液-液萃取，回收溶劑，分別得到石油醚組分（PS）、乙酸乙酯組分（PA）、氯仿組分（PC）、正丁醇組分（PB）和剩余的水溶性部分（PW），將各組分中溶劑充分揮發(fā)或蒸干，重復(fù)三次[8]。樣品冷凍干燥，備用。

1.2.2大葉苦丁茶成分分析依照王曦[9]方法定性分析各種提取物中化學(xué)成分的種類，初步確定其中可能的活性物質(zhì)。檢測(cè)是否存在氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、糖類、鞣酸、酚類、生物堿類、甾醇類、環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸、油、揮發(fā)油、蒽醌類、黃酮類、香豆素和內(nèi)酯類化合物。隨后根據(jù)定性分析結(jié)果按照孫文基[10]，采用比色法對(duì)可能存在的物質(zhì)分別進(jìn)行定量測(cè)定。

1.2.3提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）是一種穩(wěn)定的自由基。將DPPH以50%乙醇配制成25μmol/L的溶液，反應(yīng)體系為2.0mL一定濃度提取物和2.0mL DPPH，空白組以2.0mL 50%乙醇代替DPPH，對(duì)照為2.0mL 50%乙醇和2.0mL DPPH，各組反應(yīng)液在室溫下靜置30min后測(cè)定517nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以清除率表示，計(jì)算公式如下[11]：

清除率I（%）=[1-（A樣品-A空白）/A對(duì)照]×100

式中：A樣品為樣品溶液吸光度值，A空白和A對(duì)照分別為空白組和對(duì)照組吸光度值。采用PS、PA、PC、PB、PW分別代表石油醚組、乙酸乙酯組、氯仿組、正丁醇組和剩余的水提物組；黃酮苷和蟲(chóng)草多糖為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.2.4大葉苦丁茶提取物體內(nèi)抗氧化活性的研究將70只小鼠隨機(jī)分成7組，每組10只，雌雄各半。分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、PA組、PC組、PB組、PW組。除空白組每天皮下注射生理鹽水外，其余各組小鼠每天皮下注射D-半乳糖，給藥劑量為125mg/kg，連續(xù)45d。建模同時(shí)灌胃給藥?？瞻捉M和模型組每日口服生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠給予100mg/（kg·d）維生素E，實(shí)驗(yàn)組小鼠分別給予400mg/（kg·d）的PA、PC、PB或PW提取物。末次給藥后，眼眶靜脈叢取血，3500r/min離心10min，取血清，-20℃保存，并采用試劑盒測(cè)定血清中SOD和MDA活力[12]。

2　結(jié)果與分析

2.1大葉苦丁茶提取物制備

100g干燥的大葉苦丁茶用85%的乙醇提取后，得到（12.4±1.8）g粗提物，用100mL蒸餾水重懸，隨后根據(jù)大葉苦丁茶中組分的極性差異，分別采用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇對(duì)粗提物進(jìn)行萃取，以單位質(zhì)量苦丁茶原料中得到的提取物質(zhì)量計(jì)算提取率，結(jié)果如表1所示。其中石油醚萃取物提取率最低，乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物提取率最高，說(shuō)明粗提物中非極性物質(zhì)較少，而極性大的物質(zhì)更容易被85%乙醇溶液提取出來(lái)，相對(duì)于傳統(tǒng)的氯仿等單一溶劑提取，對(duì)大葉苦丁茶的利用率更高。

表1　大葉苦丁茶有效成分提取結(jié)果Table.1　Extraction result of the main components extracted from Ilex Kudingcha C.J.Tsing

表2　粗提物化學(xué)成分初步分析結(jié)果Table.2　Preliminary chemical analysis results of crude extracts

2.2大葉苦丁茶提取物中成分鑒別

由于每種化學(xué)物質(zhì)均可以通過(guò)顏色反應(yīng)進(jìn)行鑒別，采用了多種方法鑒別未知組分的種類，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，石油醚萃取組分中不含有檢測(cè)的幾種物質(zhì)，可能是由于石油醚非極性強(qiáng)，主要能溶解的是脂質(zhì)類物質(zhì)。此外，乙酸乙酯萃取組分主要為酚類和黃酮類，氯仿萃取組分中主要為蛋白質(zhì)和生物堿類，正丁醇萃取組分主要為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，而水相主要含有蛋白質(zhì)和糖類。通過(guò)比色法測(cè)定PA、PC、PB和PW中各種物質(zhì)的含量，結(jié)果顯示PA中總多酚含量為0.5%，總黃酮含量為0.6%。PC中蛋白質(zhì)含量為3.5%，總生物堿含量為0.6%，PB中蛋白質(zhì)含量為12.4%，PW中蛋白質(zhì)含量為4.8%，多糖含量為1.2%。

2.3大葉苦丁茶各組分的抗氧化活性比較

2.3.1對(duì)DPPH自由基的清除作用大葉苦丁茶分級(jí)提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖1所示。五種提取物中，PS無(wú)抗氧化能力，而PA、PC、PB、PW都具有一定的清除DPPH自由基作用，且都具有劑量依賴性，隨著給藥濃度的逐漸增加，其對(duì)DPPH自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)。PA對(duì)DPPH自由基清除作用最好，當(dāng)其濃度為100mg/mL時(shí)，最高清除率可達(dá)到50%。其次是PW、PC和PB。PB中含有較多含量的蛋白質(zhì)，在經(jīng)過(guò)氯仿和正丁醇萃取后多變性，較難維持抗氧化活性。與黃酮苷、蟲(chóng)草多糖對(duì)照品的抗氧化活性比較可以看出，PA和黃酮苷對(duì)DPPH自由基的清除作用接近，而PW和蟲(chóng)草多糖具有相似的抗氧化結(jié)果，可以推測(cè)，大葉苦丁茶中具有抗氧化作用的物質(zhì)可能是黃酮和多糖類，但是PA萃取物中的多酚成分是否也同樣具有抗氧化活性，有待進(jìn)一步研究。

2.3.2大葉苦丁茶提取物體內(nèi)抗氧化活性的研究SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫。而（MDA）是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一。脂質(zhì)過(guò)氧化能夠破壞體內(nèi)多種蛋白質(zhì)，其增強(qiáng)被認(rèn)為是機(jī)體發(fā)生多種疾病的誘因[13]。D-半乳糖能導(dǎo)致小鼠發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，經(jīng)過(guò)維生素E、PA、PC、PB、PW治療后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中SOD和MDA活性如圖2所示。從圖2中可以看出，D-半乳糖導(dǎo)致模型組小鼠體內(nèi)SOD活性明顯降低，而MDA產(chǎn)量增加，說(shuō)明小鼠體內(nèi)發(fā)生過(guò)氧化，建模成功。通過(guò)PA、PC、PB、PW的治療后，過(guò)氧化得到了有效控制，尤其是PA組和PW組，與陽(yáng)性對(duì)照組治療效果接近，與模型組有顯著差異（p＜0.01），這與體外的結(jié)果相一致。PC和PB治療效果稍差。

圖2　大葉苦丁茶提取物對(duì)小鼠血清中SOD和MDA活力的影響Fig.2　Effect of Kudingcha extracts on SOD and MDA activity in mice

3　結(jié)論

大葉苦丁茶以其食藥兩用，而一直被用作傳統(tǒng)的保健茶飲品。其活性成分包括多酚類、多糖類、黃酮類及多種微量元素。但是傳統(tǒng)的提取方法繁復(fù)，原料利用效率低。采用不同極性的溶劑分級(jí)提取，既降低了成本，也提高了原料的利用率。此外，還比較研究了不同的提取物體內(nèi)和體外的抗氧化活性，結(jié)果表明乙酸乙酯、氯仿、正丁醇和水萃取組分均具有一定的抗氧化活性，通過(guò)成分鑒定，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物中含有多酚和黃酮類物質(zhì)，而氯仿萃取物中含有蛋白質(zhì)類和生物堿，水提物中含有多糖和蛋白質(zhì)。本文為大葉苦丁茶在工業(yè)上的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)，具有很廣闊的應(yīng)用前景。

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Comparison of the antioxidant activity of different extracts from Ilex Kudingcha C.J.Tsing

JIN Ya-xiang，SUN Jing，LI Hong-jun*
（China-Japan Union Hospital of Jilin University，Jilin University，Changchun 130033，China）

Ilex Kudingcha C.J.Tsing was a traditional tea drinks both edible and medicinal，containing a variety of active components.In order to improve the extraction efficiency of kudingcha，85%ethanol was used as solvent，and were followed by liquid-liquid extraction with equal volume of petroleum ether，ethyl acetate，chloroform and n-butanol，respectively.The petroleum ether component（PS），the acetate component（PA），chloroform component（PC），n-butanol component（PB）and the remaining portion of the water-soluble（PW）were obtained.They were identified by chemical methods and the anitoxidant activity of which were investigated both in vivo and in vitro.Results showed that the main component of ethyl acetate were phenols and flavonoids，chloroform extraction components were protein and alkaloids，n-butanol extract were protein substances，and the aqueous phase containing mainly protein and sugar，respectively.PA could significantly scavenge the DPPH free radical when the concentration was 100mg/mL，the highest removal rate was 50% followed by PW，PC and PB.In addition，PA and PW could significantly increase the activity of SOD，decreased the production of MDA in serum in vivo.

Ilex Kudingcha C.J.Tsing；antioxidant activity；fractional extraction

TS272.5

A

1002-0306（2015）04-0151-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.024

2014－05－26

金亞香（1962-），女，博士，護(hù)師，研究方向：康復(fù)保健與活性物質(zhì)研究。

李洪軍（1960-），男，博士，教授，研究方向：康復(fù)保健與活性物質(zhì)研究。