李祚丹，季金茍，劉　莉，陳園園，何　慧，徐　溢，穆小靜

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，重慶400044）

一種適宜分離純化虎杖中白藜蘆醇的大孔樹(shù)脂的修飾研究

李祚丹，季金茍*，劉莉，陳園園，何慧，徐溢，穆小靜

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，重慶400044）

以制備一種更適宜分離純化白藜蘆醇的大孔吸附樹(shù)脂為研究目標(biāo)。在五種大孔吸附樹(shù)脂中，篩選出了NKA-II大孔吸附樹(shù)脂，將其氯甲基化后再接枝苯胺，得NKA-II-苯胺，將NKA-II和NKA-II-苯胺樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附和解吸進(jìn)行對(duì)比研究。NKA-II-苯胺樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附和解吸性能有明顯的增強(qiáng)，當(dāng)上樣溶液pH=4，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為0.10mg·mL-1，吸附時(shí)間為300min，以乙醇60%解吸時(shí)，其對(duì)白藜蘆醇的吸附率由87.62%提高到95.85%，解吸率由88.75%提高到92.19%。說(shuō)明新制備的NKA-II-苯胺樹(shù)脂更適宜分離純化白藜蘆醇。

虎杖，白藜蘆醇，大孔吸附樹(shù)脂，接枝，分離純化

白藜蘆醇為多年生草本植物虎杖的重要活性物質(zhì)之一[1-2]，屬天然的抗氧化劑，有多種藥理活性，如降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)、血管舒張，保持血液暢通，預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展，抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等[3]。目前，從虎杖中分離純化白藜蘆醇的方法主要有氧化鋁柱層析法、硅膠柱層析法、聚丙烯酸樹(shù)脂和大孔樹(shù)脂法等。相比而言，大孔樹(shù)脂具有比表面積大、吸附容量高、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)[4-6]，因而是目前的研究熱點(diǎn)。本文探索了不同大孔吸附樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附和解吸情況，篩選出最優(yōu)的大孔吸附樹(shù)脂，并在其結(jié)構(gòu)上進(jìn)行接枝修飾，進(jìn)一步考察了修飾后樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附和解吸性能，以期找到一種更為適宜的大孔吸附樹(shù)脂，為工業(yè)化生產(chǎn)白藜蘆醇奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品純度：99%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BL121020-1；虎杖莖根重慶科瑞南海制藥有限公司；AB-8、NKA-II、NKA-9、D101、H103大孔吸附樹(shù)脂南開(kāi)大學(xué)化工廠；無(wú)水乙醇、鹽酸AR，川東化工集團(tuán)化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉AR，成都市科龍化工試劑廠。

T6型新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-C型恒溫振蕩箱江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海嘉鵬科技有限公司；Tecrai 10型掃描電子顯微鏡荷蘭Philips公司；5DX/550Ⅱ型傅里葉-紅外光譜儀美國(guó)Nicolet公司；Phs-3C型精密pH計(jì)上海雷磁儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1白藜蘆醇提取液的制備稱(chēng)取20.00g虎杖粗粉，每次以200mL 75%乙醇在60℃下加熱回流3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇得濃縮液，在濃縮液中加入pH=2的30%的乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過(guò)夜，減壓抽濾得不溶物為大黃素的粗提物，溶解物即為白藜蘆醇提取液[7]，備用。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密稱(chēng)取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品0.0300g，用30%乙醇溶解，配成白藜蘆醇質(zhì)量濃度為6.00μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL對(duì)照品儲(chǔ)備液加入到10mL容量瓶中，以30%乙醇定容。

以30%乙醇溶液為參比，在190～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。在最大吸收波長(zhǎng)處，以吸光度-質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程。

1.2.3大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理將AB-8、NKA-II、NKA-9、D101和H103五種樹(shù)脂各取適量，分別用乙醇浸泡24h，放出浸液，用乙醇洗至流出液與水1∶5混合不渾濁，以水洗至無(wú)醇味。再用5%HCl通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2～4h，水洗至中性，2%NaOH通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2～4h，水洗至中性，備用。

1.2.4不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇分離效果的影響準(zhǔn)確稱(chēng)取上述預(yù)處理后的樹(shù)脂（去表面水分）1.00g，置于具塞錐形瓶中，再加入0.10mg·mL-1白藜蘆醇提取液50.00mL，30℃下振蕩吸附24h，測(cè)定溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率（De，%）。將吸附后樹(shù)脂過(guò)濾，以50.00mL 60%乙醇振蕩解吸24h，測(cè)定解吸液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率（Dd，%），選取最優(yōu)的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行修飾研究。De和Dd按下式計(jì)算：

式中：ρ0吸附前溶液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；ρ1吸附后溶液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；ρ2解吸液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V1樣品溶液體積（mL）；V2解吸液體積（mL）。

1.2.5樹(shù)脂的修飾鑒于白藜蘆醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有典型的酚羥基，本研究設(shè)計(jì)在篩選出的樹(shù)脂中引入能與酚羥基形成氫鍵的氨基，以增強(qiáng)其選擇吸附性[8]。

1.2.5.1氯甲基化反應(yīng)以常規(guī)的Friedel-Craft氯甲基化反應(yīng)在樹(shù)脂骨架中引入氯甲基（—CH2Cl）[9]。反應(yīng)過(guò)程如下：取預(yù)處理過(guò)的大孔吸附樹(shù)脂50g，加入到帶有攪拌器、溫度計(jì)和回流冷凝器的三口瓶中，再加入250mL氯甲醚。室溫下靜置4h后開(kāi)始攪拌，分兩次加入75g無(wú)水氯化鋅，在50～52℃反應(yīng)8h。冷卻至室溫，濾出氯化母液，以甲醇反復(fù)洗凈反應(yīng)后制得的產(chǎn)物，抽濾，得氯甲基化大孔吸附樹(shù)脂（簡(jiǎn)稱(chēng)氯球）。

1.2.5.2接枝苯胺向裝有電動(dòng)攪拌器、回流冷凝管和溫度計(jì)的三口瓶中，加入DMF溶脹的氯球50g，適量苯胺，升溫至60℃，攪拌20h。反應(yīng)完成后冷卻過(guò)濾，以乙醇洗滌后再抽提8h，晾干，即得樹(shù)脂的苯胺修飾產(chǎn)物。

1.2.5.3修飾后大孔樹(shù)脂的表征用傅里葉紅外光譜儀對(duì)修飾后的大孔樹(shù)脂進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，用掃描電子顯微鏡觀察其形貌。

1.2.6吸附等溫線配制系列不同濃度的白藜蘆醇提取液。準(zhǔn)確稱(chēng)取修飾前后的樹(shù)脂各2.00g分別加入到錐形瓶中，各取以上白藜蘆醇溶液50.00mL，分別加入到錐形瓶中，30℃下振搖吸附24h后，測(cè)定此時(shí)溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度以計(jì)算De。

1.2.7pH對(duì)吸附率的影響取相同濃度的白藜蘆醇提取液，將其pH分別調(diào)至3、4、5、6、7。準(zhǔn)確稱(chēng)取修飾前后的兩種樹(shù)脂各2.00g分別加入到錐形瓶中，各取以上白藜蘆醇溶液50.00mL，分別加入到錐形瓶中，30℃下振搖吸附24h，使其達(dá)到吸附平衡。測(cè)定此時(shí)各溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度以計(jì)算De。

1.2.8最佳靜態(tài)吸附時(shí)間準(zhǔn)確稱(chēng)取修飾前后的兩種樹(shù)脂各2.00g分別加入到錐形瓶中，取白藜蘆醇提取液50.00mL，加入到錐形瓶中，30℃下振搖吸附，每30min取樣一次，測(cè)定各溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度以計(jì)算樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的De。將吸附飽和的大孔樹(shù)脂懸浮液離心，棄去上清，將樹(shù)脂自然晾干，留待備用。

1.2.9乙醇濃度對(duì)解吸率的影響取1.2.8項(xiàng)下留待備用的達(dá)吸附平衡的干燥樹(shù)脂等量于不同帶塞錐形瓶中，再分別加入50.00mL不同濃度的乙醇溶液，30℃振搖解吸24h，測(cè)定此時(shí)溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度并計(jì)算Dd。

2　結(jié)果與分析

2.1白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)光譜掃描確定白藜蘆醇的檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.1413X+ 0.0217，r=0.9996，白藜蘆醇在1.26～5.51μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2大孔吸附樹(shù)脂的篩選

表1為五種不同的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附、解吸性能的比較，綜合考慮五種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的De和Dd，NKA-II樹(shù)脂最適宜用來(lái)分離純化白藜蘆醇。

表1　大孔吸附樹(shù)脂的篩選（n=3）Table.1　Macroporous resin type of screening（n=3）

2.3NKA-II苯胺修飾后產(chǎn)物的表征

2.3.1紅外光譜表征圖1為NKA-II與NKA-II苯胺修飾后（NKA-II-苯胺）樹(shù)脂的紅外圖譜。從圖1的a、b圖譜對(duì)比可以看出，光譜曲線a在3442.1cm-1的吸收峰為NKA-II樹(shù)脂的功能基羥基的O-H伸縮振動(dòng)；樹(shù)脂氯甲基化后再接枝苯胺，分子中引入氨基，會(huì)形成分子間和分子內(nèi)氫鍵，氫鍵的形成使電子云密度平均化體系能量下降，吸收峰向低波數(shù)位移，并使吸收強(qiáng)度加強(qiáng)，光譜曲線b中，在3417cm-1處會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰；再者在b中1223.7cm-1處的吸收峰為分子中的脂肪族仲胺基的特征峰，系樹(shù)脂氯甲基化后再接枝苯胺所引入，綜合以上信息可知苯胺已被成功引入NKA-II樹(shù)脂中。

圖1　NKA-II樹(shù)脂與NKA-II-苯胺樹(shù)脂的紅外圖譜Fig.1　FT-IR spectra of NKA-II and NKA-II-aniline resin注：a：NKA-II樹(shù)脂；b：NKA-II-苯胺樹(shù)脂；圖2同。

2.3.2掃描電子顯微鏡表征圖2為NKA-II與NKAII-苯胺樹(shù)脂的掃描電子顯微鏡圖譜（SEM），從圖2的a，b圖譜比較可以看出，兩者的形貌幾乎沒(méi)有變化，可見(jiàn)在NKA-II上接枝苯胺后，并沒(méi)有破壞NKA-II大孔吸附樹(shù)脂的原有結(jié)構(gòu)。

圖2　NKA-II樹(shù)脂與NKA-II-苯胺樹(shù)脂的掃描電鏡圖譜Fig.2　SEM of NKA-II and NKA-II-aniline resin

2.4NKA-II-苯胺和NKA-II樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇分離純化效果的比較

2.4.1吸附等溫線圖3為NKA-II樹(shù)脂和NKA-II-苯胺樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇吸附等溫線的比較。在各濃度項(xiàng)下，NKA-II-苯胺樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附率明顯強(qiáng)于NKA-II樹(shù)脂，可見(jiàn)苯胺的引入，明顯增強(qiáng)了其對(duì)白藜蘆醇的吸附。在0.10mg·mL-1時(shí)，兩者的吸附率均達(dá)到最大，故在實(shí)驗(yàn)中提取液的白藜蘆醇質(zhì)量濃度取0.10mg·mL-1。

圖3　吸附等溫線（n=3）Fig.3　Adsorption isotherms（n=3）

2.4.2pH對(duì)吸附率的影響圖4為在白藜蘆醇質(zhì)量濃度為0.10mg·mL-1時(shí)，pH對(duì)NKA-II和NKA-II-苯胺樹(shù)脂吸附白藜蘆醇的影響。由圖4可知，在各pH項(xiàng)下，NKA-II-苯胺對(duì)白藜蘆醇的吸附率都明顯大于NKA-II；在pH=4時(shí)，NKA-II-苯胺樹(shù)脂的吸附率達(dá)到最大，為95.87%，而NKA-II樹(shù)脂的最大吸附率出現(xiàn)在pH=5，這時(shí)的吸附率為87.73%。

圖4　pH對(duì)吸附率的影響（n=3）Fig.4　Effect of pH on adsorption rate（n=3）

2.4.3最佳靜態(tài)吸附時(shí)間圖5為NKA-II和NKAII-苯胺大孔吸附樹(shù)脂分別在pH=5和pH=4時(shí)對(duì)白藜蘆醇的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。由圖5可知，NKA-II-苯胺總吸附量增大，其對(duì)白藜蘆醇的吸附速率也有一定的提高，在300min時(shí)，吸附基本達(dá)到平衡狀態(tài)，吸附率為95.85%，此時(shí)NKA-II樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附率為87.62%。故最佳靜態(tài)吸附時(shí)間為300min。

圖5　吸附動(dòng)力學(xué)曲線（n=3）Fig.5　Adsorption kinetics curves（n=3）

2.4.4乙醇濃度對(duì)解吸率的影響圖6為乙醇濃度對(duì)NKA-II和NKA-II-苯胺樹(shù)脂解吸白藜蘆醇的影響。由圖6可知，隨著乙醇濃度的增大，大孔樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的解吸率逐漸增強(qiáng)。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，兩種樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的解吸基本達(dá)到平衡狀態(tài)，解吸率分別為88.75%和92.19%，可見(jiàn)NKA-II-苯胺樹(shù)脂的解吸性能優(yōu)于NKA-II樹(shù)脂。

3　結(jié)論

綜合考慮五種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附率和解吸率，NKA-II樹(shù)脂最適宜用來(lái)分離純化白藜蘆醇。對(duì)NKA-II樹(shù)脂進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，將其氯甲基化，再接枝苯胺，引入了可與白藜蘆醇分子中的羥基形成氫鍵的仲胺鍵。對(duì)白藜蘆醇的吸附和解吸性有了明顯的增強(qiáng)，當(dāng)樣品溶液溶液pH=4，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為0.10mg·mL-1，吸附時(shí)間為300min，乙醇60%解吸時(shí)，其對(duì)白藜蘆醇的吸附率由87.62%提高到95.85%，解吸率由88.75%提高到92.19%。可見(jiàn)NKAII-苯胺樹(shù)脂更適宜用于白藜蘆醇的分離純化。

圖6　乙醇濃度對(duì)解吸率的影響（n=3）Fig.6　Effect of ethanol concentration on the desorption rate（n=3）

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Modification of the macroporous resin for purifying resevratrol in Polygonum cuspidatum

LI Zuo-dan，JI Jin-gou*，LIU Li，CHEN Yuan-yuan，HE Hui，XU Yi，MU Xiao-jing
（Faculty of Pharmacy，College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China）

To synthesize a more suitable macroporous resin for purifying resevratrol in Polygonum cuspidatum. The best resin NKA-II，selected in five kinds of macroporous resins by their adsorption and desorption properties to resevratrol，was chloromethylated and grafted with aniline.After purifying the sample extract with NKA-II-aniline resin，the adsorption and desorption capacity to resveratrol were obviously enhanced.When the sample extract at pH=4，the concentration of resveratrol was 0.10mg·mL-1，adsorption time of 300min and elute solution of 60%ethanol，the adsorption rate increased from 87.62%to 95.85%，the desorption rate increased from 88.75%to 92.19%.The results indicated that the new NKA-II-aniline resin may be a promising macroporous resin for the separation and purification of resveratrol in Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum；resveratrol；macroporous resin；modification；purification

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0140-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.021

2014－05－12

李祚丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然藥物提取。

季金茍（1962-），男，博士，教授，研究方向：藥物化學(xué)。

重慶市墊江縣“121”醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)科技支持示范工程項(xiàng)目（2012-2015）；重慶市科技攻關(guān)（一般）計(jì)劃項(xiàng)目（CSTC：2011AC5071）。