武明欣 王際英 李寶山 張德瑞 蔡勝昌 王世信 孫永智 張利民*

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306;2.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省海洋資源與環(huán)境研究院，煙臺(tái) 264006;3.山東升索漁用飼料研究中心，煙臺(tái) 265500)

飼用酶制劑是一種以酶為主要功能性因子，通過特定生產(chǎn)工藝加工而成的飼料添加劑。飼用酶制劑可刺激內(nèi)源消化酶分泌，降低腸道食糜黏度，提高飼料轉(zhuǎn)化率;減少或消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子;提高機(jī)體免疫抵抗能力，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物健康生長［1］。目前，酶制劑在飼料中的應(yīng)用主要集中于畜禽方面，在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用僅見于草魚［2－3］、異育銀鯽［4－5］、尼羅羅非魚［6］、大黃魚［7－8］等少數(shù)種類，在刺參上的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

刺參屬海參綱(Holothuroidea)，海參科(Holothuriidae)。近年來隨著刺參食用和藥用價(jià)值不斷被發(fā)現(xiàn)［9］，其越來越受到養(yǎng)殖者和消費(fèi)者青睞。隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，各種病害及環(huán)境脅迫影響也愈漸顯著，給刺參養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。酶制劑作為一種綠色環(huán)保、無藥物殘留的新型飼料添加劑，可有效提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長性能和疾病抵抗能力，得到了許多研究者的關(guān)注［10］。刺參飼料中含有大量的纖維素和半纖維素，很難被直接吸收利用。酶制劑能破壞植物細(xì)胞壁，將植物纖維分解為容易被吸收利用的小分子多糖或葡萄糖，促進(jìn)內(nèi)源酶的分泌，提高飼料利用率［11］。本試驗(yàn)擬通過研究幾種單體酶及其復(fù)合酶對刺參生長、體成分、免疫能力及氨氮脅迫下免疫酶活力和熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)含量的影響，以期為酶制劑在刺參配合飼料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，促進(jìn)綠色飼料添加劑的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)組，分別為對照組、木聚糖酶組、纖維素酶組、淀粉酶組和復(fù)合酶組，每個(gè)組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)體重(4.02±0.04)g的幼參40頭。試驗(yàn)所用木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶活力分別為10 000、1 000、2 000 U/g。共配制粗蛋白質(zhì)含量為20%的5種試驗(yàn)飼料，首先配制不添加酶制劑的基礎(chǔ)飼料作為對照，然后分別以0.04%木聚糖酶、0.10% 纖維素酶、0.01% 淀粉酶、0.15%復(fù)合酶(由0.04%木聚糖酶、0.10%纖維素酶和0.01%淀粉酶組成)等量替代基礎(chǔ)飼料中的α－淀粉。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。固體原料超微粉碎過200目標(biāo)準(zhǔn)篩，按配比稱重，加入新鮮魚油及適量蒸餾水混勻，用小型顆粒飼料擠壓機(jī)制成直徑為0.3 cm的顆粒，60℃烘干，用小型粉碎機(jī)破碎，篩選粒度在80～100目之間的顆粒備用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

續(xù)表1

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院東營試驗(yàn)基地循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，試驗(yàn)用刺參為該基地當(dāng)年繁育的同一批參苗。試驗(yàn)開始前，將1 000頭刺參幼參放養(yǎng)于養(yǎng)殖系統(tǒng)中，暫養(yǎng)15 d，期間投喂基礎(chǔ)飼料，待其完全適應(yīng)飼養(yǎng)條件后，選擇體質(zhì)健壯、體重(4.02±0.04)g的刺參幼參600頭，平均放養(yǎng)于15個(gè)圓柱形玻璃鋼養(yǎng)殖桶中。每種飼料投喂3個(gè)養(yǎng)殖桶，試驗(yàn)期為56 d。試驗(yàn)在微流水環(huán)境中進(jìn)行，采用充氣增氧，保證溶氧濃度＞7 mg/L，控制水溫在18～20 ℃，pH 7.8～8.2，鹽度24 ～26，亞硝酸氮濃度 ＜0.05 mg/L、氨氮濃度 ＜0.05 mg/L。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)56 d，每天投喂2次(08:00、16:30)，日投喂量為刺參體重的2%，根據(jù)試驗(yàn)刺參攝食情況及時(shí)調(diào)整投喂量。每隔2 d吸底1次，用虹吸法將殘餌及糞便吸出。

1.3 樣品收集

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食48 h，記錄每桶刺參總數(shù)并稱量總重，用于成活率、增重率及特定生長率的計(jì)算。每桶取10頭刺參，用濾紙輕輕吸干體表水分，稱體重，待其自然舒展后量體長，用于肥滿度的計(jì)算。用2 mL無菌注射器抽取體腔液后，置冰盤上解剖，分別稱量體壁與腸道重量，并測量腸道長度。體腔液在4℃條件下，以3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于2 mL的離心管中，同體壁、腸道樣品一同保存于－80℃冰箱，待測。

1.4 氨氮脅迫試驗(yàn)

樣品收集后，封閉循環(huán)水系統(tǒng)，用氯化銨(NH4Cl)調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水氨氮濃度約為5 mg/L，繼續(xù)飼養(yǎng)試驗(yàn)刺參 5 d，并分別在試驗(yàn)的 0、24、48、72、96、120 h采集試驗(yàn)刺參的體腔液，用于免疫酶活力和HSP70含量的測定。

1.5 測定指標(biāo)和方法

1.5.1 生長指標(biāo)

1.5.2 飼料及體壁基本營養(yǎng)成分的測定

飼料及體壁基本營養(yǎng)成分采用常規(guī)方法測定:干物質(zhì)含量采用105℃烘干至恒重法(GB/T 6435—2006);粗蛋白質(zhì)含量采用杜馬斯燃燒法(Leco-FP528);粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994);粗灰分含量采用550℃馬福爐灼燒法(GB/T 6438—2007);木聚糖含量采用分光光度法;粗纖維含量采用過濾法(GB/T 6434—2006);淀粉含量采用旋光法(GB/T 20194—2006);能量采用燃燒法(PARR，6100)。

1.5.3 免疫酶活力的測定

溶菌酶(LZM)活力采用空白對照比濁法測定;超氧化物歧化酶(SOD)活力采用羥胺法測定，定義為每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位(U);過氧化氫酶(CAT)活性采用可見光分光光度計(jì)法測定，定義為每毫升體腔液每秒鐘分解1μmol的過氧化氫(H2O2)的量為1個(gè)活力單位(U)。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定。

1.5.4 HSP70 含量的測定

HSP70含量采用上海拜沃生物科技有限公司的試劑盒以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行測定。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品加入到純化的海參HSP70單克隆抗體包被的微孔板中，加入酶聯(lián)親和物，37℃孵育60 min，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物 A 和 B，底物 3，3'，5，5'－ 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下先轉(zhuǎn)化為藍(lán)色后變?yōu)辄S色。在450 nm波長下測定光密度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值計(jì)算樣品中HSP70的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007及SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，差異顯著(P＜0.05)時(shí)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 酶制劑對刺參生長性能的影響

由表2可見，飼料中添加木聚糖酶、纖維素酶和復(fù)合酶均能顯著提高刺參的增重率和特定生長率(P＜0.05)，且添加木聚糖酶和復(fù)合酶的促生長效果尤其明顯，其增重率分別比對照組提高了17.38%和20.75%。木聚糖酶組的臟體比和腸長比均顯著高于對照組(P＜0.05)，纖維素酶組的臟體比顯著高于對照組(P＜0.05)，淀粉酶組的肥滿度顯著高于對照組(P＜0.05)，復(fù)合酶組的肥滿度、臟體比、腸體比和腸長比均顯著高于對照組(P＜0.05)。飼料中添加單體酶和復(fù)合酶對成活率也有一定提高，但影響不顯著(P＞0.05)。

表2 酶制劑對刺參生長性能的影響Table 2 Effects of enzyme preparation on growth performance of Apostichopus japonicus

2.2 酶制劑對刺參體壁基本營養(yǎng)成分的影響

由表3可見，飼料中添加不同酶制劑對刺參體壁水分含量無顯著影響(P＞0.05)，但添加木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和復(fù)合酶均顯著提高了體壁粗蛋白質(zhì)和粗灰分的含量(P＜0.05)，添加淀粉酶和復(fù)合酶均顯著提高了體壁粗脂肪的含量(P＜0.05)。

表3 酶制劑對刺參體壁基本營養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of enzyme preparation on basal nutritional components of body wall of Apostichopus japonicas %

2.3 酶制劑對刺參免疫能力的影響

由表4可見，飼料中添加木聚糖酶、纖維素酶和復(fù)合酶均顯著提高了體腔液中過氧化氫酶的活力(P＜0.05);添加淀粉酶顯著提高了體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力(P＜0.05)。體腔液中溶菌酶和超氧歧化酶活力均以淀粉酶組最高，過氧化氫酶活力以復(fù)合酶組最高。

表4 酶制劑對刺參體腔液中免疫酶活力的影響Table 4 Effects of enzyme preparation on immune enzyme activities in coelomic fluid of Apostichopus japonicus

2.4 酶制劑對氨氮脅迫下刺參體腔液中免疫酶活力和HSP70含量的影響

由圖1可見，氨氮脅迫過程中各組刺參體腔液中溶菌酶活力的總體趨勢是先升高后降低，對照、木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、復(fù)合酶組最大值分別出現(xiàn)在72、72、96、96 和 96 h。其中，淀粉酶、復(fù)合酶組的最大值要高于其余各組。氨氮脅迫過程中各組刺參體腔液中SOD活力均先升高，并均在24 h達(dá)到最大值，之后降低并于48 h后趨于穩(wěn)定，且其穩(wěn)定值略低于初始值。氨氮脅迫過程中各組刺參體腔液中CAT活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并均在96 h達(dá)到最大值，其中淀粉酶組的最大值要高于其他各組。

氨氮脅迫下，試驗(yàn)初期復(fù)合酶組刺參體腔液中HSP70含量明顯高于其他各組。木聚糖酶組刺參體腔液中HSP70的含量呈現(xiàn)一直升高的趨勢，其余各組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。復(fù)合酶組體腔液中HSP70含量比其他組率先達(dá)到最高點(diǎn)，且在96 h后趨于穩(wěn)定。對照、纖維素酶、淀粉酶組體腔液中HSP70含量于96 h達(dá)到最大值。除纖維素酶組外，其余加酶組體腔液中HSP70含量的最大值均高于對照組。

圖1 氨氮脅迫過程中刺參體腔液溶菌酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力及HSP70含量的變化Fig.1 Changes of LZM，SOD and CAT activities and HSP70 content in coelomic fluid under the stress of ammonia nitrogen of Apostichopus japonicus

3 討論

3.1 酶制劑對刺參生長性能和體成分的影響

本研究表明，飼料中添加酶制劑顯著提高了刺參的增重率和特定生長率，這與在鯽魚［12］、尼羅羅非魚［13－15］、黃河鯉［16］和大西洋鮭［17］上的研究結(jié)果相一致。酶制劑促進(jìn)刺參生長，可能有以下幾方面原因:1)飼料中添加木聚糖酶能有效降低腸道食糜黏度，降解非淀粉質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高養(yǎng)殖動(dòng)物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而改善養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)性能［18－19］。2)纖維素酶能破壞細(xì)胞壁、降低飼料密集黏度，同時(shí)刺激內(nèi)源酶的分泌，從而提高水產(chǎn)動(dòng)物對營養(yǎng)成分的消化吸收［20］。3)飼料中添加淀粉酶起作用的主要為α－淀粉酶和糖化酶。α－淀粉酶為內(nèi)切酶，將淀粉大分子水解成易溶解的中等和低分子物質(zhì)，有利于糖化酶的水解。糖化酶為內(nèi)切酶，其活性的高低直接影響到動(dòng)物的生長［21］。4)復(fù)合酶綜合了幾種單體酶的作用，又不僅僅是單個(gè)酶作用的復(fù)合。鄧岳松［22］在研究中發(fā)現(xiàn)由纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等組成的復(fù)合酶對飼料中的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子具有滅活作用，可消除草魚對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收困難，從而提高魚體的生長性能。黃峰等［23］研究表明，添加復(fù)合酶促進(jìn)異育銀鯽生長的效果稍好于單一添加木聚糖酶，這可能得益于復(fù)合酶的疊加效應(yīng)和協(xié)同效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，添加復(fù)合酶的促生長效果優(yōu)于添加單體酶。

本研究表明，飼料中添加酶制劑對刺參體壁粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均有顯著影響。這與王俊麗等［13］、黃燕華等［24］的研究結(jié)果相一致。飼料中添加木聚糖酶能提高腸道蛋白酶活力，增加腸道內(nèi)游離氨基酸和小肽數(shù)量，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和積累。同時(shí)，添加木聚糖酶降低了腸道食糜黏度，腸道活動(dòng)增強(qiáng)，從而促進(jìn)了對脂肪的吸收，增加了體壁中脂肪的沉積。添加木聚糖酶使腸道中低聚木糖增加，低聚木糖的代謝降低了腸道pH，增強(qiáng)了鈣鹽的溶解性，促進(jìn)了鈣的吸收，從而提高了粗灰分的含量［13］。而鐘國防等［6］、張璐等［7］的研究證明，飼料中添加酶制劑對養(yǎng)殖動(dòng)物的基本營養(yǎng)成分均無顯著影響。這可能與添加酶的種類、活力及養(yǎng)殖動(dòng)物種類有關(guān)。

3.2 酶制劑對刺參免疫能力的影響

刺參沒有完善的特異性免疫，溶菌酶、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶在其免疫及抗氧化過程中起著重要作用［25］。溶菌酶活力的高低直接反映出溶菌能力的強(qiáng)弱［26］，超氧化物歧化酶活力與生物體免疫水平密切相關(guān)［27］，過氧化氫酶保護(hù)機(jī)體組織免受損害［25］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加酶制劑對刺參各免疫指標(biāo)均有促進(jìn)作用。其中，木聚糖酶組體腔液中溶菌酶和過氧化氫酶活力與對照組相比有顯著提高;淀粉酶體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活力均較對照組有顯著提高。這與黃燕華等［24］、鐘國防等［15］、黃峰等［4－5］的研究結(jié)果一致。黃燕華等［24］研究證實(shí)，飼料中添加淀粉酶能顯著提高對蝦血清超氧化物歧化酶活力。鐘國防等［15］研究表明，在尼羅羅非魚飼料中添加木聚糖酶和復(fù)合酶能顯著提高魚體肝臟和脾臟中超氧化物歧化酶和溶菌酶活力。目前關(guān)于刺參體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶正常活力范圍的研究并不充足，尤其是酶活力升高的機(jī)理尚不清楚，因此不能單純依據(jù)酶活力來評定其免疫及抗氧化能力的強(qiáng)弱，但是在大菱鲆等魚類上的研究表明，魚體抗病能力的提高往往伴隨著溶菌酶、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活力的升高［28］，由此可以推測在一定范圍內(nèi)，上述3種酶活力的升高提高了機(jī)體的抗逆性。

3.3 酶制劑對氨氮脅迫下刺參體腔液中免疫酶活力和HSP70含量的影響

熱休克蛋白是一種應(yīng)激反應(yīng)的指示器，它能使細(xì)胞處于保護(hù)狀態(tài)，它的產(chǎn)生能使細(xì)胞抵抗致死性損傷，增強(qiáng)細(xì)胞對外界損害的耐受力［25］。本試驗(yàn)過程中，在5 mg/L的氨氮濃度脅迫下，各組刺參體腔液中免疫酶活力均表現(xiàn)出一定的上升趨勢。這主要是由于氨氮脅迫增強(qiáng)了刺參體內(nèi)水解系統(tǒng)的活性，表現(xiàn)出明顯的毒物興奮作用［29］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加酶制劑能提高刺參的免疫性能，因此在短時(shí)間內(nèi)各加酶組表現(xiàn)出比對照組更迅速和強(qiáng)烈的免疫抵抗反應(yīng)。隨著脅迫時(shí)間的延長，刺參自身的水解系統(tǒng)活性降低，抵抗力下降［25］，因此各組免疫酶活力隨后表現(xiàn)出下降趨勢。氨氮脅迫72 h內(nèi)，各組刺參體腔液中HSP70含量均呈上升趨勢。這說明，刺參通過提高HSP70的表達(dá)量，增強(qiáng)抗逆性，以適應(yīng)氨氮脅迫的環(huán)境［25］。氨氮脅迫開始前(即0 h)，復(fù)合酶組刺參體腔液中HSP70的含量明顯高于其他各組，其次為木聚糖酶組。氨氮脅迫48 h內(nèi)，纖維素酶、淀粉酶和復(fù)合酶組刺參體腔液中HSP70含量與對照組相比表現(xiàn)出較快的升高，且復(fù)合酶組更早的達(dá)到最高點(diǎn)。這可能與酶制劑促進(jìn)刺參自身免疫和脅迫抵抗有關(guān)。

4 結(jié)論

①飼料中適量添加木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或其復(fù)合酶均能提高刺參的生長，提高免疫能力，并對刺參體壁粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分的含量也有一定影響，且木聚糖酶的促生長作用更明顯，而淀粉酶的促免疫作用更明顯。

②氨氮脅迫下，飼料中適量添加聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或其復(fù)合酶均能使刺參更迅速和強(qiáng)烈的表現(xiàn)出免疫抵抗反應(yīng)。

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