嚴(yán)淑紅 邢文麗 方洛云 王俊杰 劉續(xù)航 蔣林樹

(奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

隨著生活水平的不斷提高及營養(yǎng)科學(xué)研究的進(jìn)步，人們對(duì)牛奶的品質(zhì)要求也越來越高。乳脂是牛奶中的重要組成部分，也是牛奶品質(zhì)重要衡量指標(biāo)之一，與其他固體成分(乳蛋白和乳糖)相比，乳脂的含量易受飼糧調(diào)控而發(fā)生改變［1］。在奶牛飼糧中添加調(diào)節(jié)劑可調(diào)控乳脂含量，但是化學(xué)藥物和抗生素的殘留問題一直困擾著乳產(chǎn)品的安全，研究開發(fā)新型、安全、綠色飼料添加劑代替化學(xué)添加劑成為一種必然趨勢。

植物提取物具有天然性、殘留少、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，已經(jīng)成為畜牧養(yǎng)殖和科研機(jī)構(gòu)研究的重點(diǎn)。茶皂素，又稱油茶皂苷，是一種從山茶科植物中提取的五環(huán)三萜類植物皂苷總稱［2］，由7種配基、4種糖體和2種有機(jī)羧酸組成，主要存在于茶種子和茶葉中［3］。茶皂素在抗氧化、抗?jié)B消炎、抑菌、抗溶血等方面都能發(fā)揮作用［4］。茶皂素不僅是一種天然的表面活性劑而且具有廣泛的生物活性作用，還可用作反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能［5］。葉均安等［6］研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)底物中分別添加0.25%、0.50%和1.00%茶皂素，瘤胃原蟲生長受到可不同程度的抑制，瘤胃發(fā)酵狀況得到改善。來海良等［7］報(bào)道在瘤胃液體外培養(yǎng)物中添加茶皂素可抑制瘤胃原蟲的數(shù)量增加，增加瘤胃微生物的數(shù)量，使瘤胃發(fā)酵合成微生物蛋白的產(chǎn)量增多。苑文珠［8］研究證明，體外培養(yǎng)的條件下添加茶皂素提高了瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量，總揮發(fā)性脂肪酸及乙酸、丙酸、丁酸的產(chǎn)量增加。彭春雨等［9］研究報(bào)道，在奶牛飼糧中添加茶皂素和植物蛻皮甾酮可提高產(chǎn)奶量，但對(duì)乳脂率、乳料比和血液生化指標(biāo)均無顯著影響，分析其原因可能與添加劑量少有關(guān)。在蛋白質(zhì)水平與分子水平上，關(guān)于茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞合成乳脂的影響研究還鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^研究茶皂素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及乳脂合成關(guān)鍵酶含量和基因表達(dá)的影響，探究茶皂素對(duì)奶牛乳腺合成乳脂的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

茶皂素購自浙江東方茶葉有限公司常山分公司，皂甙含量≥95%。

選用1頭體況良好體重約550 kg，年齡為4歲2胎、泌乳期為100 d、日均產(chǎn)奶量約30 kg/d的荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，由北京市順義區(qū)中地畜牧科技有限公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物取材

常規(guī)麻醉，在乳房基部至乳頭連線中央切開長約5 cm的切口，采取1 g左右的乳腺組織，置于事先準(zhǔn)備好的DMEM/F－12完全培養(yǎng)液(30%胎牛血清、300 IU/mL青霉素、300 IU/mL鏈霉素)中，帶回實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步處理，方法參照文獻(xiàn)［10］，采用胰蛋白酶、膠原酶消化液分離獲取乳腺上皮細(xì)胞，該方法時(shí)間短，得到細(xì)胞純度高［11］。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將茶皂素用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成不同濃度梯度的儲(chǔ)存液，于－20℃保存?zhèn)溆?，使用前?%DMEM/F-12維持培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，使其終濃度分別為 0(對(duì)照)、0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00μg/mL，收集處于對(duì)數(shù)期的乳腺上皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度使乳腺上皮細(xì)胞密度為100～10 000個(gè)/孔，加入不同濃度梯度的茶皂素溶液，每個(gè)濃度梯度設(shè)5個(gè)重復(fù);37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24、48、72 h后，檢測乳腺上皮細(xì)胞增殖狀況;根據(jù)細(xì)胞增殖測定結(jié)果，修正茶皂素溶液濃度梯度為 0、0.50、5.00、20.00 μg/mL，選取同一代的生長性能良好的乳腺上皮細(xì)胞，添加不同濃度茶皂素溶液培養(yǎng)。每瓶加3 mL茶皂素溶液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，消化細(xì)胞，測細(xì)胞中乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的含量;每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4、24、48 h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為參照基因，測定目的基因SCD、ACACA、FASN基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 乳腺上皮細(xì)胞鑒定

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入一塊蓋玻片，讓玻片與板底完好接觸，在蓋玻片的中央滴加消化好的細(xì)胞懸液，于30℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%左右時(shí)棄培養(yǎng)液，取出蓋玻片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次3 min;－20℃在甲醇∶丙酮(1∶1)中于4℃固定5 min后，快速用PBS洗滌;用羊血清封閉液常溫孵育15 min;用PBS清洗3次，每次3 min;加入抗角蛋白18一抗120μL(1∶100)，置濕盒中4℃過夜，再次用PBS洗滌;加入二抗［異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗小鼠］120μL(1∶100)于室溫避光孵育1 h，用PBS洗清3次，每次3 min;將1滴抗熒光猝滅劑滴于培養(yǎng)板上，封固，陰性對(duì)照用PBS代替一抗;在倒置數(shù)碼熒光顯微鏡下觀察角蛋白18的特異性表達(dá)，并拍照［12］。乳腺上皮細(xì)胞鑒定方法參照文獻(xiàn)［13］。

1.3.2 乳腺上皮細(xì)胞增殖

噻唑藍(lán)(MTT)法檢測茶皂素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量的影響。

1.3.3 乳脂合成關(guān)鍵酶含量

用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)SCD、ACACA、FASN 的含量。

1.3.4 乳脂合成關(guān)鍵酶基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平

采用相對(duì)定量的方法，以β-actin參照基因，測定目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，使用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并由上海生物工程股份有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序參照BrilliantⅢUltra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行。溶解曲線均為單一峰值。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR原始檢測結(jié)果，采用2－ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式分析細(xì)胞內(nèi)SCD、ACACA、FASN基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。計(jì)算公式如下:

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters for fluorescence－based quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用相對(duì)定量2－ΔΔCt法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和整理。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行平均值的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

本試驗(yàn)采用時(shí)間短、純度高的酶消化法分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，得到的原代細(xì)胞呈放射狀生長，純化3代后獲得純度95%以上的乳腺上皮細(xì)胞，培養(yǎng)過程中上皮細(xì)胞呈鋪路石樣，如圖1所示。

采用上皮細(xì)胞特征性物質(zhì)角蛋白18對(duì)純化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，角蛋白18能與FITC標(biāo)記的二抗結(jié)合而使細(xì)胞質(zhì)著色。在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞為乳腺上皮細(xì)胞，而不加一抗的陰性對(duì)照組則不顯熒光，如圖2所示。

2.2 茶皂素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

由圖3可知，茶皂素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖具有抑制作用。茶皂素與細(xì)胞共育24 h后，0～10.00μg/mL茶皂素濃度組乳腺上皮細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，與0μg/mL茶皂素濃度組相比，從20.00μg/mL茶皂素濃度組開始會(huì)極顯著抑制細(xì)胞增殖(P＜0.01);茶皂素與細(xì)胞共育48 h后，0～20.00μg/mL茶皂素濃度組乳腺上皮細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，與0μg/mL組相比，從40.00μg/mL茶皂素濃度組開始會(huì)極顯著抑制細(xì)胞增殖(P＜0.01);茶皂素與細(xì)胞共育72 h后，0～5.00μg/mL茶皂素濃度組乳腺上皮細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，與0μg/mL組相比，從10.00μg/mL茶皂素濃度組開始會(huì)極顯著抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖(P＜0.01)。鑒于茶皂素會(huì)不同程度抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，所以，選用低劑量茶皂素濃度組，即對(duì)細(xì)胞增殖影響不顯著的試驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，即 0、0.50、5.00、20.00 μg/mL茶皂素濃度梯度組。

圖1 原代乳腺上皮細(xì)胞Fig.1 Primary mammary epithelial cells

2.3 茶皂素對(duì)乳脂合成關(guān)鍵酶的影響

由表2可見，茶皂素與乳腺上皮細(xì)胞共育36 h后，各組ACACA、FASN、SCD含量均無顯著差異(P＞0.05)。其中，與對(duì)照組相比，ACACA 含量0.5、5.0、20.00 μg/mL 茶皂素濃度組有一定程度的上 升;與 對(duì) 照 組 相 比，F(xiàn)ASN 含 量 0.50、5.00μg/mL茶皂素濃度組表現(xiàn)上升趨勢，而在20.00μg/mL茶皂素濃度組表現(xiàn)下降趨勢;SCD含量在0.50、5.00、20.00μg/mL茶皂素濃度組與 對(duì)照組相比均呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 角蛋白18結(jié)合的乳腺上皮細(xì)胞Fig.2 Mammary epithelial cells combined with keratin 18

圖3 茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of tea saponin on mammary epithelial cell proliferation

表2 茶皂素濃度對(duì)乳腺上皮細(xì)胞SCD、ACACA、FASN含量的影響Table 2 Effects of tea saponin on SCD，ACACA and FASN contents in mammary epithelial cell μg/mL

由表3可見，乳腺上皮細(xì)胞與茶皂素共育4、24、48 h后，各組ACACA基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異不顯著(P ＞0.05)，其中，24 h時(shí)在 0.50、5.00μg/mL茶 皂 素 濃 度 組 有 所 下 降，但 在20.00μg/mL茶皂素濃度組又有所回升。由表4可見，乳腺上皮細(xì)胞與茶皂素共育4、24、48 h后，各組FASN基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異不顯著(P ＞0.05)，其中，共育 4 h后，基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平有所提高，之后表現(xiàn)下降趨勢。由表5可見，乳腺上皮細(xì)胞與茶皂素共育4、24、48 h后，與對(duì)照組相比，SCD基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平在茶皂素濃度為0.50、5.00、20.00 μg/mL 時(shí)受茶皂素的抑制作用顯著(P＜0.05)，其基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平在 24 h 后分別下調(diào)到 0.17、0.05、0.12，48 h 后分別下調(diào)到 0.08、0.05、0.18。

表3 茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞ACACA基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響Table 3 Effects of tea saponin on the relative expression level of ACACA mRNA in mammary epithelial cell

表4 茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞FASN基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響Table 4 Effects of tea saponin on the relative expression level of FASN mRNA in mammary epithelial cell

表5 茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞SCD基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響Table 5 Effects of tea saponin on the relative expression level of SCD mRNA in mammary epithelial cell

3 討論

3.1 茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

乳腺上皮細(xì)胞是乳脂的合成場所，乳腺上皮細(xì)胞正常的生命周期活動(dòng)是分泌乳脂的前提保證。細(xì)胞增殖是指通過細(xì)胞分裂增加細(xì)胞數(shù)量，它既是生物繁殖的根本途徑，又是維持細(xì)胞數(shù)量平衡和機(jī)體正常功能所必需的基礎(chǔ)條件。而細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指死亡信號(hào)誘發(fā)細(xì)胞凋亡的過程，是細(xì)胞生理性死亡的普遍形式［14］。各種細(xì)胞內(nèi)因素及機(jī)體外界因素如化學(xué)物質(zhì)作用、溫度變化、pH變化等都會(huì)對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生重要影響，從而影響細(xì)胞的增殖與調(diào)亡。朱麗麗等［15］的研究結(jié)果表明重樓皂甙能夠抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖。吳葆華等［16］研究結(jié)果同樣表明桔梗皂苷D對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。彭春燕［17］研究結(jié)果顯示100和200μg/mL濃度組的桔梗總皂苷相對(duì)空白組存在顯著性差異，能夠顯著抑制山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖。這些研究均與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似。

本試驗(yàn)通過MTT法檢測茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示茶皂素與乳腺上皮細(xì)胞共育24 h后，從20.00μg/mL茶皂素濃度組開始會(huì)極顯著地抑制細(xì)胞增殖;茶皂素與細(xì)胞共育48 h后，從40.00μg/mL茶皂素濃度組開始會(huì)極顯著地抑制細(xì)胞增殖;茶皂素與細(xì)胞共育72 h后，從10.00μg/mL茶皂素濃度組開始會(huì)極顯著地抑制細(xì)胞增殖。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，乳腺上皮細(xì)胞與茶皂素共育的時(shí)間越長，茶皂素開始對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著抑制的濃度越低，分析原因可能是茶皂素作用于乳腺上皮細(xì)胞可能有一定過程，但是具體的作用機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)探究與分析了茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響規(guī)律，同時(shí)可為進(jìn)一步研究茶皂素對(duì)乳脂合成的影響提供濃度選擇的試驗(yàn)依據(jù)。

3.2 茶皂素對(duì)乳脂合成關(guān)鍵酶含量和基因表達(dá)的影響

牛乳脂主要由是甘油三酯(triglyceride，TG)構(gòu)成，而機(jī)體合成甘油三酯主要有2條途徑:乳腺上皮細(xì)胞以乙酰輔酶A為原料從頭合成全部的C14脂肪酸和1/2的C16脂肪酸;C18以上的長鏈脂肪酸全部是由乳腺上皮細(xì)胞從血液中吸收的［18］。ACACA、FASN、SCD 是乳脂合成中的重要酶系，其中，ACACA、FASN主要對(duì)脂肪酸從頭合成起作用，而脂蛋白酯酶則主要對(duì)從血液中攝取發(fā)揮作用，SCD同時(shí)調(diào)節(jié)以上2條途徑［19］。目前，關(guān)于茶皂素對(duì)乳脂合成作用的研究比較少，茅慧玲等［20］的研究結(jié)果表明飼糧中添加茶皂素可以顯著降低肌肉中飽和脂肪酸的含量，而對(duì)不飽和脂肪酸含量有增加趨勢，但未達(dá)到顯著水平。王延芳［21］試驗(yàn)結(jié)果也表明油茶皂素可控制高脂小鼠的體重，驗(yàn)證了油茶皂素的減肥作用，油茶皂素堿水解產(chǎn)物和酸水解產(chǎn)物明顯降低血清中的膽固醇含量。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)水平上，上述3種酶受茶皂素調(diào)控的作用不顯著，除ACACA含量有一定程度的上調(diào)外，其余基本呈下降趨勢。而在基因水平上，SCD基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平在0.50、5.00、20.00 μg/mL 茶皂素濃度組時(shí)出現(xiàn)顯著下降。這說明茶皂素對(duì)奶牛乳脂合成關(guān)鍵酶基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響隨著其濃度、作用時(shí)間及酶基因的不同而有所變化，一定范圍內(nèi)具有抑制作用。

茶皂素廣泛存在于茶葉、茶籽中，而我國自古以來就是茶葉大國，因此具有巨大的茶皂素資源，雖然茶皂素作為表面活性劑和生物活性劑在農(nóng)業(yè)［22］、工業(yè)［23］、漁業(yè)養(yǎng)殖［24］等有一定的應(yīng)用，但是尚未得到充分開發(fā)利用。周奕毅［25］、Hu等［26］研究報(bào)道茶皂素可作為反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，影響瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，改善瘤胃微生物發(fā)酵，提高飼糧蛋白質(zhì)利用率，降低甲烷產(chǎn)量，提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能。牛奶生物活性脂肪酸研究方面揭示瘤胃和乳腺對(duì)脂肪酸合成具有協(xié)同機(jī)制［27］，但茶皂素對(duì)這種協(xié)同機(jī)制的影響，目前尚不清楚。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)茶皂素能在一定程度上可抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖和乳脂合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，為解決低脂乳品和化學(xué)添加劑殘留問題提供了新的解決思路，同時(shí)為進(jìn)一步研究茶皂素作為調(diào)控奶牛生產(chǎn)性能與牛乳品質(zhì)的天然飼料添加劑提供了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

茶皂素對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖具有抑制作用，但具有濃度依賴性，同時(shí)受到作用時(shí)間的影響;茶皂素一定程度上可顯著抑制乳脂合成關(guān)鍵酶SCD基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，而對(duì)ACACA、FASN基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平無顯著影響。

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