王林林 陳培欽 羅 云 李夏蘭

(華僑大學化工學院，廈門 361021)

本課題組前期研究結(jié)果表明:阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，F(xiàn)AE)與木聚糖酶存在協(xié)同作用，能提高麥糟中阿魏酸(4－羥基－3－甲氧基肉桂酸，ferulic acid，F(xiàn)A)及低聚木糖(xylooligosaccharide，XOS)的釋放率，有利于麥糟的降解。在優(yōu)化的工藝條件下，木聚糖酶和FAE共同作用于植物細胞壁，F(xiàn)A釋放量最高可達0.97 mg/g(干麥糟)，XOS 的釋放量為 161 mg/g(干麥糟)［1］。在發(fā)酵飼料安全、有效、不污染環(huán)境、無耐藥性的基礎上，本課題將固態(tài)發(fā)酵得到的FAE添加于杏鮑菇菌柄的發(fā)酵飼料原料中，欲提高抗營養(yǎng)因子的降解效率，同時產(chǎn)生對動物具有生理作用且安全無毒的FA和XOS［2］。FA具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗突變、抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗血栓、降低膽固醇和降血脂等生理功能［3］;XOS其無毒安全的特性，已成為最具潛力的動物保健品和抗生素替代品［4］。本文研究了FAE酶化發(fā)酵飼料的品質(zhì)及FAE酶化發(fā)酵飼料對肉雞生產(chǎn)性能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用20日齡黃腳麻雞180只，將肉雞分為4組，每組5個重復，每個重復9只雞，試驗前稱重。試驗組1為對照組(基礎飼糧中添加10%菌柄)，試驗組2為基礎飼糧中添加10%普通發(fā)酵飼料(僅添加益生菌劑發(fā)酵)，試驗組3為基礎飼糧中添加10%FAE酶化飼料(僅添加FAE酶化)，試驗組4為基礎飼糧中添加10%酶化發(fā)酵飼料(添加益生菌劑發(fā)酵及FAE酶化)。采用地面平養(yǎng)方式飼養(yǎng)，全天光照，每天飼喂3次，自由采食、飲水，定時對雞舍進行消毒清掃(每周2次)，試驗時間為25 d，按正常肉雞免疫程序進行免疫。

肉雞基礎飼糧標準參照NY/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標準》中肉雞營養(yǎng)需要配制［5］，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗材料

1.2.1 主要器材

反式阿魏酸標準品(美國sigma公司);阿魏酸甲酯(華僑大學曾慶友老師合成);XOS標準品、木二糖標準品(日本和光純藥工業(yè)株式會社);超濾膜包Vivaflow 200(MWCO 30KD)(北京Sartorius公司);發(fā)酵袋(鄭州百益寶生物科技有限公司)。1 100高效液相色譜儀(美國Agilent公司);HPX－42A柱(美國Bio-Rad公司);ODS－C18色譜柱(美國Thermo公司);SP－2 102UV紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);凝膠成像系統(tǒng)GIS－2008(上海天能公司)。

1.2.2 飼料原料

玉米蛋白粉(山東濱州海星飼料廠);瓜爾豆粕(廣饒六合化工有限公司);棕櫚仁粕(大連鎂達國際貿(mào)易有限公司);預混料(廈門百穗行科技有限公司);益生菌劑(1.0×1010CFU/g)(山東寶來利來生物工程公司);杏鮑菇菌柄(福建嘉勝集團大建飼料有限公司)。

1.2.3 雞苗

黃腳麻雞(廈門五顯鎮(zhèn)三秀種禽廠)。

1.2.4 試驗地點和時間

廈門市集美區(qū)仙靈旗農(nóng)莊，試驗時間為2013年4—5月。

1.3 飼料發(fā)酵方法

1.3.1 FAE 粗酶液的制備

1.3.1.1 菌種

黑曲霉，實驗室自行篩選并保藏。

1.3.1.2 培養(yǎng)基成分

種子培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基［6］，36 ℃，200 r/min培養(yǎng)2 d。發(fā)酵培養(yǎng)基:麥糟及麥麩干燥粉碎過100目篩，麥糟∶麥麩=1∶4(m/m)比例加入白瓷盤中并按1∶1.5(m/V)添加營養(yǎng)鹽溶液，混勻，121℃滅菌30 min，33℃培養(yǎng)6 d。營養(yǎng)鹽溶液:蛋白胨 0.2%，酵母粉 0.4%，NaH2PO4·2H2O 0.152%，KH2PO40.1%，CaCl20.03%，MgSO4·7H2O 0.03%，Na2HPO4·12H2O 3.14 g，Na2HPO4·2H2O 1.56% 。

1.3.1.3 粗酶液的制備

發(fā)酵料中加入8倍體積的蒸餾水，33℃，180 r/min中抽提2.5 h，靜置，用 8 層紗布過濾，得濾液，再將濾液超濾制備得FAE粗酶液，F(xiàn)AE粗酶液酶活達20 U/mL以上。超濾條件為操作溫度20℃、壓力0.1 MPa及進料速度200 mL/min。

1.3.2 普通發(fā)酵飼料及酶化發(fā)酵飼料的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基(以干物質(zhì)計):菌柄12%，玉米蛋白26%，棕櫚仁粕11%，谷殼粉16%，瓜爾豆粕5%，玉米粉5%，糖蜜0.3%。

普通發(fā)酵飼料制備:將發(fā)酵培養(yǎng)基加入0.1%益生菌劑混合均勻，裝入發(fā)酵袋常溫發(fā)酵。每袋質(zhì)量為1 000 g。

酶化發(fā)酵飼料制備:按8 U/g干菌柄將FAE粗酶液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再加入0.1%益生菌劑混合均勻，裝入發(fā)酵袋常溫發(fā)酵。每袋質(zhì)量為1 000 g。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 飼料常規(guī)成分測定

粗蛋白質(zhì)含量按GBT 6432—1994《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》分析［7］;中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)含量按 GB/T 20806—2006《飼料中中性洗滌纖維的測定》分析［8］;酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量按 NY/T 1459—2007《飼料中酸性洗滌纖維的測定》分析［9］;酸 性 洗 滌 木 質(zhì) 素 (acid detergent lignin，ADL)含量按GB/T 20805—2006《飼料中酸性洗滌木質(zhì)素的測定》分析［10］。

1.4.2 總氨基酸、乳酸含量測定

總氨基酸含量采用南京建成生物工程研究所的總氨基酸測定試劑盒，原理為銅離子(Cu2+)與氨基酸的顯色反應［11］。乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸測試盒測定，原理為乳酸脫氫酶的顯色反應［12］。

1.4.3 總菌數(shù)、乳酸菌數(shù)測定

總菌數(shù)按GB/T 13093—2006《飼料中細菌總數(shù)的測定》分析［13］。乳酸菌數(shù)按 GB 4789.35—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》分析［14］。

1.4.4 飼料發(fā)酵前后小分子肽變化測定

采用不連續(xù)凝膠電泳分析［15］。上層丙烯酰胺5%，下層丙烯酰胺15%。

1.4.5 XOS 和 FA 含量測定

XOS含量采用HPLC測定。HPX－87H色譜柱，示差折光檢測器。柱溫50℃，流動相5 mmol/L的硫酸，流速 0.4 mL/min［6］。

FA含量采用HPLC法測定。色譜柱為ODS－C18柱，318 nm檢測，柱溫30℃。流動相為甲醇∶水∶冰醋酸 =30∶69.5∶0.5(V/V/V)，流速為0.9 mL/min［6］。

1.4.6 飼料衛(wèi)生指標檢測

飼料送至福建省分析檢測中心，按GB 13078—2001《飼料衛(wèi)生標準》［16］分析。

1.4.7 肉雞雞肉品質(zhì)

肉雞送至福建省分析檢測中心，按GB 18406.3—2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量 無公害畜禽安全要求》［17］分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件的ANOVA進行方差分析，Duncan氏法進行多重比較，各組數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中影響飼料品質(zhì)的因素變化

2.1.1 發(fā)酵過程中飼料重量變化

由表2可知，發(fā)酵過程中2個試驗組飼料重量都呈下降趨勢，第0天與第15天飼料重量差異顯著(P＜0.05)，隨著發(fā)酵進行，酶化發(fā)酵飼料重量減少比普通發(fā)酵飼料多，說明酶化發(fā)酵飼料代謝較徹底。發(fā)酵過程中飼料重量的減少是由于發(fā)酵基料水分的揮發(fā)、發(fā)酵過程中微生物的活動及酶促反應，使基料中的碳水化合物及蛋白質(zhì)等大分子有機物分解成小分子物質(zhì)而損失。

2.1.2 發(fā)酵過程中FA含量變化

由表3可知，在整個發(fā)酵過程中普通發(fā)酵飼料 FA 含量在 0.23～0.40 mg/g，變化范圍小;而酶化發(fā)酵飼料隨著發(fā)酵時間的延長，F(xiàn)A含量迅速上升，第10天 FA含量達最高，為4.11 mg/g，與第0天比，差異極顯著(P＜0.01)。這是因為在酶化發(fā)酵飼料中加入了FAE，F(xiàn)AE與益生菌產(chǎn)生的木聚糖酶協(xié)同作用釋放出FA;而普通發(fā)酵飼料因沒有添加FAE，發(fā)酵過程中FA含量很低。

2.1.3 發(fā)酵過程中XOS含量變化

由表4可知，2個試驗組發(fā)酵開始，XOS含量都是隨著發(fā)酵時間增加而增加，但酶化發(fā)酵飼料XOS含量明顯比普通發(fā)酵飼料高，這是由于酶化發(fā)酵飼料添加的FAE與益生菌產(chǎn)生的木聚糖酶協(xié)同作用，提高了XOS的含量。發(fā)酵第10天，酶化發(fā)酵飼料其XOS含量達最高，為36.33 mg/g，與第0天比，差異顯著(P＜0.05);而普通發(fā)酵飼料第9天達最高，為20.43 mg/g，與第0天比，差異顯著(P＜0.05)，隨后2個試驗組XOS含量都緩慢下降。

表2 飼料重量隨發(fā)酵時間變化Table 2 Feed quality changed with fermentation time g

表3 飼料中FA含量隨發(fā)酵時間變化Table 3 Content of FA in feed changed with fermentation time mg/g

表4 飼料中XOS含量隨發(fā)酵時間變化Table 4 Content of XOSin feed changed with fermentation time mg/g

2.1.4 發(fā)酵過程中粗蛋白質(zhì)含量變化

由表5可知，在整個發(fā)酵過程中，酶化發(fā)酵飼料的粗蛋白質(zhì)含量高于普通發(fā)酵飼料。這是因為FAE的加入，增加飼料中XOS的量，而XOS有利于益生菌劑中乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌的繁殖，從而提高了酶化發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)的含量。發(fā)酵第5天，酶化發(fā)酵飼料及普通發(fā)酵飼料粗蛋白質(zhì)含量都達最高，酶化發(fā)酵飼料粗蛋白質(zhì)含量到達24.67%，與第0天比，差異極顯著(P＜0.01);而普通發(fā)酵飼料最高為23.15%，與第0天比，差異顯著(P＜0.05)，隨后粗蛋白質(zhì)含量都緩慢下降。試驗結(jié)果與胡瑞等［18］研究酶菌聯(lián)合發(fā)酵對豆粕品質(zhì)影響時，粗蛋白質(zhì)含量變化結(jié)果一致。

2.1.5 發(fā)酵過程中總氨基酸含量變化

由表6可知，在整個發(fā)酵過程中，酶化發(fā)酵飼料總氨基酸含量都高于普通發(fā)酵飼料。發(fā)酵開始，2個試驗組中總氨基酸含量都隨著發(fā)酵時間增加而增加，第8天酶化發(fā)酵飼料及普通發(fā)酵飼料總氨基酸含量都達最高，分別為 21.26、13.29 mg/g，與第0天比，差異顯著或極顯著(P＜0.05或P＜0.01)，隨后總氨基酸含量逐漸下降。與李龍等［19］利用復合益生菌發(fā)酵飼料時，總氨基酸的變化趨勢一致。

表5 飼料中粗蛋白質(zhì)含量隨發(fā)酵時間變化Table 5 Content of crude protein in feed changed with fermentation time %

表6 飼料中總氨基酸含量隨發(fā)酵時間變化Table 6 Content of total amino acid in feed changed with fermentation time mg/g

2.1.6 發(fā)酵過程中總菌數(shù)變化

如表7可知，在發(fā)酵開始階段，由于飼料中營養(yǎng)豐富，2個試驗組總菌數(shù)都是呈上升趨勢，第10天酶化發(fā)酵飼料總菌數(shù)為22.00×105個/g，與第0天比，差異顯著(P＜0.05)，第9 天普通發(fā)酵飼料總菌數(shù)為10.00 ×105個/g，與第0天比，差異顯著(P＜0.05);隨后，乳酸的生成使得飼料中pH降低，導致飼料中有些菌不適應環(huán)境而數(shù)量開始減少;發(fā)酵后期總菌數(shù)保持穩(wěn)定，這與賈鵬輝等［20］試驗結(jié)果相類似。酶化發(fā)酵飼料可能由于FAE作用，產(chǎn)生較多XOS，促進益生菌大量增殖而總菌數(shù)較普通發(fā)酵飼料多。

表7 飼料中總菌數(shù)隨發(fā)酵時間變化Table 7 Total number of bacteria in feed changed with fermentation time 個/g

2.1.7 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)變化

如表8可知，發(fā)酵開始，酶化發(fā)酵飼料及普通發(fā)酵飼料乳酸菌數(shù)都是呈上升趨勢，在第12天其菌數(shù)都達最大，其乳酸菌數(shù)分別為 9.300×105及3.200×105個/g，與第 0天比，差異都顯著(P ＜0.05)。之后由于乳酸菌處于衰亡期，2個試驗組的乳酸菌數(shù)開始下降并趨于平衡。

2.1.8 發(fā)酵過程中乳酸含量變化

從表9可知，整個發(fā)酵過程2個試驗組乳酸含量一直增加，在第10天，酶化發(fā)酵飼料乳酸含量達最大，為8.79 g/kg，與第0天比，差異顯著(P ＜0.05);普通發(fā)酵飼料在第9天達最大，為7.14 g/kg，與第0天比，差異顯著(P＜0.05)。經(jīng)過一定時間發(fā)酵后，乳酸菌增殖減緩，分泌的乳酸減少，乳酸含量維持在一定水平。乳酸含量增加會提高飼料的適口性，對動物的生長有積極的促進作用。

表8 飼料中乳酸菌數(shù)隨發(fā)酵時間變化Table 8 Number of Lactobacillus in feed changed with fermentation time 個/g

表9 飼料中乳酸含量隨發(fā)酵時間變化Table 9 Content of lactate in feed changed with fermentation time g/kg

2.1.9 發(fā)酵過程中飼料pH變化

由表10可知，發(fā)酵第1天，2個試驗組pH基本一致，第3天后，由于乳酸菌的繁殖，導致pH下降，由于酶化發(fā)酵飼料乳酸菌較普通發(fā)酵飼料多，使得酶化發(fā)酵飼料的pH較低。發(fā)酵第15天，酶化發(fā)酵飼料的pH為4.25，普通發(fā)酵飼料的pH為4.32，與第0天比，差異都極顯著(P＜0.01)。

表10 飼料中p H隨發(fā)酵時間變化Table 10 The pH of feed changed with fermentation time

2.1.10 發(fā)酵過程中 ADF、ADL、NDF 含量變化趨勢

由表11可知，酶化發(fā)酵飼料中ADL、ADF和NDF含量都比普通發(fā)酵飼料要低，且第10天2種發(fā)酵飼料ADL、ADF和NDF含量與第0天比都差異顯著或極顯著(P＜0.05或P＜0.01)。這是因為酶化發(fā)酵飼料中FAE與益生菌劑中微生物分泌的非淀粉降解酶協(xié)同降解發(fā)酵原料中的木質(zhì)纖維，提高了木質(zhì)纖維的降解率，因此酶化發(fā)酵飼料在降低飼料中抗營養(yǎng)因子的同時還能提高飼料中的營養(yǎng)成分。

2.1.11 發(fā)酵過程飼料中小分子肽變化

圖1可知，隨著發(fā)酵時間進行，普通發(fā)酵飼料與酶化發(fā)酵飼料中大分子蛋白質(zhì)能夠降解為小分子肽，這是因為發(fā)酵飼料中有益菌的生長產(chǎn)生了更多的蛋白質(zhì)水解酶，促進了小分子肽含量的增加。肽更容易被動物吸收，提高飼料品質(zhì)。

2.1.12 飼料衛(wèi)生指標檢測

經(jīng)檢測，酶化發(fā)酵飼料的各項衛(wèi)生指標符合GB 13078—2001《飼料衛(wèi)生標準》要求。

2.2 發(fā)酵飼料對肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.2.1 發(fā)酵飼料對肉雞成活率的影響

將不同的發(fā)酵飼料以10%的比例添加到肉雞基礎飼糧中，肉雞飼養(yǎng)結(jié)果如表12。在飼喂全程中，飼糧中未添加任何的抗生素及其他的藥物，各組雞的死亡率均為0，死亡率差異不顯著(P＞0.05)，并未體現(xiàn)出添加發(fā)酵飼料抗病的優(yōu)勢，這 可能與飼養(yǎng)管理合理，場地衛(wèi)生條件好有關。

表11 飼料發(fā)酵過程中ADF、ADL、NDF含量變化趨勢Table 11 The contents of ADF，ADL，NDF changed with fermentation time %

圖1 發(fā)酵過程飼料中小肽變化電泳圖Fig.1 Electrophoresis of small peptides before and after fermented

2.2.2 發(fā)酵飼料對肉雞生產(chǎn)性能的影響

從表13可知，與對照組相比，F(xiàn)AE酶化飼料和酶化發(fā)酵飼料均能提高肉雞平均日增重，分別提高了1.23%、4.31%，而普通發(fā)酵飼料則使肉雞平均日增重降低了1.98%，但是差異不顯著(P＞0.05)。發(fā)酵飼料能提高平均日增重，這與發(fā)酵飼料中含有更多的營養(yǎng)物質(zhì)且肉雞養(yǎng)分利用率的提高有關。普通發(fā)酵飼料、FAE酶化飼料和酶化發(fā)酵飼料均有降低平均日采食量的趨勢，分別降低了 2.58%、3.01%、8.34%，但是差異不顯著(P ＞0.05)。酶化發(fā)酵飼料對降低料重比具有極顯著的作用(P＜0.01)，降低了12.45%，雖然普通發(fā)酵飼料和FAE酶化飼料也能降低料重比，但是只分別降低1.24%和8.30%(P ＞0.05)。酶化發(fā)酵飼料與普通發(fā)酵飼料相比，肉雞平均日增重提高了6.42%(P ＞0.05)，平均日采食量降低了 5.91%(P ＞0.05)，料重比降低了 11.34%(P ＞0.05)。而本課題組的楊道秀等［21］將FAE粗酶液及商品飼料酶－“溢多酶”(主要含木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶等)添加入飼料中，試制酶化飼料飼喂肉雞，與對照組相比，肉雞平均日增重提高了4.37%，料重比降低了7.63%，與本試驗結(jié)果相近。

2.2.3 肉雞衛(wèi)生檢測指標結(jié)果

雞肉各項衛(wèi)生指標符合GB 18406.3—2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量－無公害畜禽安全要求》。

3 討論

廈漳食用菌的生產(chǎn)規(guī)模位居全國之首，在生產(chǎn)過種中，產(chǎn)生了大量的菌柄下腳料。菌柄營養(yǎng)非常的豐富，如杏鮑菇的菌柄，經(jīng)本課題組測定，粗蛋白質(zhì)含量為12.53%(干重)，多糖含量為33.74%(干重)，游離氨基酸含量為3.56%(干重)。但其非淀粉多糖抗營養(yǎng)因子高，直接飼喂動物適口性差。因此試驗選用杏鮑菇菌作為主要的發(fā)酵原料。

目前已有FAE對反芻動物飼料中提高木質(zhì)纖維降解率的報導，楊紅建等［22］申請專利《一種飼用復合阿魏酸酯酶添加劑》，表明飼料原料中添加FAE可提高牧草、農(nóng)作物秸稈及糠麩類飼料酶解過程中還原糖釋放量、細胞壁降解率以及瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生量。Krueher等［23］在百喜草、百慕達草中添加不同濃度的FAE酶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物對NDP的降解有顯著的促進作用，降解程度與酶的添加量成線性關系。這些報導關注的都是阿魏酸酯酶對飼料中非淀粉多糖降解率的影響，未涉及酶與木質(zhì)纖維降解產(chǎn)物(如阿魏酸及低聚糖)的關系及降解產(chǎn)物對動物的影響。本文研究結(jié)果表明添加了FAE的發(fā)酵飼料，不僅提高了飼料中的ADF、NDF及ADL降解率，且產(chǎn)生了對動物有生理活性的FA及XOS，飼喂肉雞時，有利于降低料重比。

表12 不同發(fā)酵飼料對肉雞成活率的影響Table 12 Effects of different fermented feed on the survival of broilers

表13 不同發(fā)酵飼料對肉雞生產(chǎn)性能的影響Table 13 Effects of different fermented feed on broiler’s performance

4 小結(jié)

①酶化發(fā)酵飼料與普通發(fā)酵飼料相比，其產(chǎn)生的XOS和FA更多，酶化發(fā)酵飼料FA含量最高為 4.11 mg/g，其 XOS 含量最高為 36.33 mg/g。

②酶化發(fā)酵飼料與普通發(fā)酵飼料相比，飼料中粗蛋白質(zhì)含量、總氨基酸含量、總菌數(shù)及乳酸菌數(shù)都更高，且其ADF、NDF及ADL在發(fā)酵過程中得到更好的降解。

③酶化發(fā)酵飼料與普通發(fā)酵飼料相比，肉雞平均日增重提高了6.42%，平均日采食量降低了5.91%，料重比降低了11.34%，而肉雞飼糧中添加普通發(fā)酵飼料和FAE酶化飼料均能夠促進肉雞的生長，但效果不顯著。

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