王海鳳 郭 兵

(河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，張家口 075000)

黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是從天然中草藥黃芪中提取的一種多糖，APS作為飼料添加劑能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［1］，被認(rèn)為是一種新型的飼料添加劑。已有研究表明，APS能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫細(xì)胞因子白細(xì)胞介素－1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素－2(IL-2)和腫瘤壞死因子 － α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)的 分泌［2－3］，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫功能。

腸黏膜是機(jī)體抵抗外源物質(zhì)及微生物的重要免疫屏障［4］，同時(shí)也是全身器官的“受損門(mén)戶(hù)”，腸源性感染可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多臟器功能衰竭［5］。小腸不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收的場(chǎng)所，而且具有重要的免疫功能。十二指腸是雞最初接觸食物的腸段，其“U”形結(jié)構(gòu)可以使食物在小腸停留較長(zhǎng)時(shí)間，從而對(duì)食物進(jìn)行較充分的消化吸收，同時(shí)十二指腸的這種特征也要求十二指腸要有一定的免疫結(jié)構(gòu)來(lái)防御夾雜于食物中的病原菌。腸黏膜免疫是免疫系統(tǒng)中重要的組成部分。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)雛雞口腔注入APS，觀察其對(duì)雞新城疫－傳染性支氣管炎(LaSota株+H120株)二聯(lián)活疫苗免疫雛雞十二指腸黏膜免疫球蛋白含量、黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量和IL-2含量的影響，分析APS對(duì)新支二聯(lián)苗免疫肉仔雞十二指腸黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用，為黃芪多糖作為功能性添加劑以及新藥的創(chuàng)制提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1日齡愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞，購(gòu)自下花園雞場(chǎng)。APS(純度72%)，河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院中獸醫(yī)教研室制備，用去離子水稀釋成不同濃度(6、4、2 mg/mL)，置4℃冰箱中備用。雞新城疫－傳染性支氣管炎(LaSota株+H120株)二聯(lián)活疫苗(批號(hào):1006004-2)，山東齊魯動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)。雞免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海邦奕生物科技有限公司。雞IL-2含量測(cè)定試劑盒，購(gòu)自尚柏生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

200只1日齡AA肉仔雞隨機(jī)分為4組，每組50只，常規(guī)飼養(yǎng)。Ⅰ組為僅用新支二聯(lián)苗免疫組，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別為 APS高、中、低劑量組。5～7日齡，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別用鈍頭注射器經(jīng)口注入3種不同濃度(6、4、2 mg/mL)APS，0.5 mL/只，每天1次，連用3 d，Ⅰ組灌服等量生理鹽水。7日齡，每只采用雞新支二聯(lián)苗2倍量點(diǎn)眼滴鼻免疫，兩側(cè)眼睛和鼻孔各滴1滴。各組雞在免疫后8、15、22日齡，隨機(jī)選取10只雞，剖殺，分離出十二指腸，擠出腸道食糜，剖開(kāi)腸腔，用0.9%生理鹽水輕輕沖洗除去腸壁上的內(nèi)容物，濾紙吸干水分，用載玻片刮取十二指腸黏膜1.0 g左右，裝入2 mL塑料安培管中，－20℃冷凍保存。同時(shí)，迅速剪取2段十二指腸，1段放入10%中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，厚度6μm。另1段低溫保存?zhèn)錂z。

1.3 IgA、IgG、IgM 含量測(cè)定

取 0.5 g(精確至 0.000 1 g)腸黏膜，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)，冰浴條件下組織勻漿，4 000×g 4℃離心20 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟用雙抗原夾心法用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中雞IgA、IgG、IgM含量。

1.4 IL-2 含量測(cè)定

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)，選用種屬特異性的IL-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定腸黏膜組織勻漿中細(xì)胞因子的含量:按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，試劑盒反應(yīng)終止后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各細(xì)胞因子含量。

1.5 腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intraepithelial lymphocyte，IEL)、杯狀細(xì)胞(goblet cell，GC)和肥大細(xì)胞(mast cell，MC)數(shù)量測(cè)定

上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量測(cè)定分別采用常規(guī)伊紅－美藍(lán)(HE)染色和過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色切片，光鏡下取每根腸管橫斷面，選5根最長(zhǎng)且排列整齊的絨毛，計(jì)數(shù)每100個(gè)黏膜上皮柱狀細(xì)胞間上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量;肥大細(xì)胞數(shù)量測(cè)定采用甲苯胺藍(lán)(MTB)染色切片，光鏡下計(jì)數(shù)每根腸管橫斷面的腸壁全層(包括黏膜及黏膜下層、肌層及漿膜層)的肥大細(xì)胞數(shù)量。

1.6 重復(fù)試驗(yàn)

在本試驗(yàn)結(jié)束后，又用同樣方法做了研究，檢驗(yàn)本試驗(yàn)的效果，但限于文章篇幅，重復(fù)試驗(yàn)有關(guān)數(shù)據(jù)本文未予列出。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，以單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 十二指腸黏膜免疫球蛋白含量的測(cè)定

圖1～圖3顯示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品已知系列濃度溶液的OD測(cè)定值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，IgA、IgG、IgM 曲線幾乎為直線，R2均大于0.990 0，符合線性關(guān)系，可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的IgA、IgG、IgM含量。

圖1 免疫球蛋白IgA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard graph of IgA

圖2 免疫球蛋白IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard graph of IgG

由表1可知，8日齡時(shí)，APS各組肉仔雞十二指腸黏膜IgA、IgG、IgM含量與對(duì)照組相比有不同程度升高，但差異不顯著(P＞0.05);15日齡時(shí)，高、中劑量組肉仔雞十二指腸黏膜IgA、IgG、IgM含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);22日齡時(shí)，中劑量組肉仔雞十二指腸黏膜IgG和IgM含量、高劑量組雛雞腸黏膜IgA和IgM含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖3 免疫球蛋白IgM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard graph of IgM

2.2 十二指腸黏膜IL-2含量的測(cè)定

由表2可知，各APS添加組肉仔雞十二指腸黏膜IL-2含量相對(duì)于對(duì)照組均有不同程度的升高，且APS對(duì)肉仔雞十二指腸黏膜IL-2含量的影響呈劑量依賴(lài)關(guān)系。8日齡時(shí)，各組肉仔雞十二指腸黏膜IL-2含量差異不顯著(P＞0.05)，但添加APS肉仔雞十二指腸黏膜IL-2含量明顯增加;15日齡時(shí)，在免疫后第1周，高、中劑量組與其他各組之間十二指腸黏膜中IL-2含量差異均極顯著(P＜0.01)，且IL-2含量依給藥劑量增加呈增加趨勢(shì);22日齡時(shí)，高、中劑量組與其他組比較仍保持顯著差異(P＜0.05)。

表1 十二指腸黏膜IgA、IgG、IgM含量Table 1 Contents of IgA，IgG and IgM in duodenum mucosa(n=6)

表2 十二指腸黏膜IL-2含量Table 2 Content of IL-2 in duodenum mucosa(n=6) pg/mL

2.3 十二指腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定

從表3可看出，8日齡時(shí)，APS使肉仔雞十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量呈增加趨勢(shì)，但各組間差異不顯著(P＞0.05);15日齡時(shí)，高、中劑量組肉仔雞十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量顯著或極顯著高于對(duì)照組(P＜0.05或 P＜0.01)，而且高劑量組肉仔雞十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組分別提高了44.18%和43.70%，差異極顯著(P＜0.01)。22日齡時(shí)，高、中劑量組肉仔雞十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組比較仍保持顯著差異(P＜0.05)。

表3 十二指腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量Table 3 Numbers of mucosal immunity-associated cells in duodenum mucosa(n=6)

3 討論

3.1 APS對(duì)肉仔雞十二指腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

家禽腸道存在大量的淋巴樣組織，構(gòu)成完整而普遍的黏膜免疫系統(tǒng)，是機(jī)體防止感染的第1道防線［6］。十二指腸黏膜表面富含大量功能不同的免疫活性細(xì)胞，當(dāng)細(xì)菌與之接觸后，使腸道派伊爾結(jié)識(shí)別抗原的能力增強(qiáng)，同時(shí)活化了腸道相關(guān)淋巴組織和B淋巴細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞。致敏的免疫細(xì)胞進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，經(jīng)胸導(dǎo)管進(jìn)入血液循環(huán)，逐步分化成熟，在全身免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用。成熟的免疫細(xì)胞在特異的歸巢受體介導(dǎo)下，歸巢到致敏部位的腸黏膜內(nèi)，形成腸黏膜內(nèi)的抗體生成細(xì)胞并分泌免疫球蛋白，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)功能［7］。免疫球蛋白是體液免疫應(yīng)答中主要的免疫效應(yīng)分子。家禽體內(nèi)的免疫球蛋白主要IgA、IgG和IgM。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口腔注入APS可以顯著提高新支二聯(lián)苗免疫肉仔雞十二指腸黏膜IgA、IgG、IgM含量，表明APS可增強(qiáng)肉仔雞腸黏膜的體液免疫反應(yīng)。腸道黏膜免疫是全身免疫的重要組成部分。APS能提高肉仔雞的免疫機(jī)能早有報(bào)道［8－9］，本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，APS 能提高肉仔雞的腸道免疫力。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，APS高劑量組肉仔雞腸黏膜IgG及APS中劑量組肉仔雞十二指腸黏膜IgA和IgM含量明顯高于對(duì)照組。

3.2 APS對(duì)肉仔雞十二指腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)的影響

通常情況下，腸道發(fā)揮免疫功能是通過(guò)定居在腸道內(nèi)的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的活動(dòng)來(lái)完成的。

位于十二指腸黏膜上皮細(xì)胞層中的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，主要由T淋巴細(xì)胞構(gòu)成，是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸抗原的免疫活性細(xì)胞，是機(jī)體黏膜免疫反應(yīng)過(guò)程中極為重要的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)［10］，其數(shù)量增加表明機(jī)體黏膜免疫力提高。黏膜上皮中杯狀細(xì)胞主要分布于腸絨毛柱狀細(xì)胞之間，杯狀細(xì)胞內(nèi)的黏液顆粒相互融合分泌黏蛋白，附于小腸上皮表面，有潤(rùn)滑和保護(hù)作用。分泌物排出后與水混合形成黏液，附著在腸黏膜表面形成“膠狀屏障(gel barrier)”，與細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)牢固結(jié)合，作為腸黏膜屏障，捕獲微生物，防止其他細(xì)菌入侵［11］。十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞是腸黏膜免疫細(xì)胞的重要組成部分，構(gòu)成腸黏膜免疫系統(tǒng)的第1道防線。他們數(shù)量的變化在一定程度上可以反映消化道的免疫狀況。本試驗(yàn)中APS顯著增加新支二聯(lián)苗免疫肉仔雞十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量，說(shuō)明APS通過(guò)對(duì)這2種細(xì)胞的影響加強(qiáng)了肉仔雞十二指腸對(duì)病原入侵的防御能力。

肥大細(xì)胞是天然免疫效應(yīng)細(xì)胞之一，能夠參與腸黏膜免疫調(diào)節(jié)，受到刺激活化后分泌組胺、白細(xì)胞介素等介質(zhì)，引起血管反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的免疫效應(yīng)［12］。機(jī)體沒(méi)有接受刺激時(shí)肥大細(xì)胞不被激活。正常組織的肥大細(xì)胞在免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間的直接雙向交流中起信息傳遞作用。從感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽與肥大細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活肥大細(xì)胞，使其脫顆粒，肥大細(xì)胞釋放的組胺能進(jìn)一步刺激感覺(jué)神經(jīng)釋放更多的神經(jīng)肽，從而使更多的肥大細(xì)胞脫顆粒，造成惡性循環(huán)［13］。本試驗(yàn)結(jié)果中，肥大細(xì)胞數(shù)量增多使神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系通路拓寬了。

此外，肥大細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子，召集樹(shù)突狀細(xì)胞，并促進(jìn)其成熟，加強(qiáng)對(duì)抗原的遞呈作用。肥大細(xì)胞發(fā)揮最佳的防御效果需要依Toll樣受體4(TLR4)的功能，通過(guò)釋放炎癥預(yù)激因子，尤其是TNF-α來(lái)介導(dǎo)。TLR4活化肥大細(xì)胞導(dǎo)致先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)［13］。本試驗(yàn)中，APS使肥大細(xì)胞數(shù)量增多，為肥大細(xì)胞更迅速的發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 APS對(duì)肉仔雞十二指腸IL-2含量的影響

IL-2主要由活化的T淋巴細(xì)胞和部分B淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是動(dòng)物體內(nèi)重要的免疫活性因子之一，能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分化增殖并維持T淋巴細(xì)胞在體外持續(xù)生長(zhǎng)。IL-2在機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫中具有重要作用。腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞主要為T(mén)淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞受到抗原或有絲分裂素［如刀豆蛋白A(ConA)等］刺激后開(kāi)始分泌IL-2，而IL-2又進(jìn)一步促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)殺傷性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)黏膜上皮自然殺傷細(xì)胞(NK)的增殖，參與黏膜免疫應(yīng)答。IL-2的分泌水平高低可以反映機(jī)體的免疫機(jī)能，特別是細(xì)胞免疫水平［14］。本試驗(yàn)中APS使肉仔雞十二指腸黏膜IL-2含量增加，提示肉仔雞十二指腸黏膜中T淋巴細(xì)胞數(shù)量可能增加，APS對(duì)肉仔雞十二指腸黏膜細(xì)胞免疫和體液免疫具有促進(jìn)作用。這一結(jié)果與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的APS增加肉仔雞十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量和IgA、IgG、IgM等免疫球蛋白含量的結(jié)果相一致。

4 總結(jié)

由此可見(jiàn)，APS可增強(qiáng)肉仔雞十二指腸黏膜免疫功能，以6、4 mg/mL劑量最佳。

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