王振斌 陳兵兵 劉加友 馬海樂 姜美花 王 林 丁清芝 曲文娟

（江蘇大學食品與生物工程學院，鎮(zhèn)江 212013）

超聲波和微波技術在芝麻餅粕ACE抑制肽制備中的應用

王振斌 陳兵兵 劉加友 馬海樂 姜美花 王 林 丁清芝 曲文娟

（江蘇大學食品與生物工程學院，鎮(zhèn)江 212013）

為了探索超聲波和微波技術在芝麻餅粕ACE抑制肽制備中的應用，分別以超聲波和微波對芝麻餅粕預處理，超聲波輔助酶解，研究了超聲波功率、超聲波時間、微波功率、微波時間和加酶量對ACE抑制率的影響。結果表明：超聲波預處理功率為4W/mL、預處理10min、添加1 300 U/g堿性蛋白酶時得到的芝麻餅粕ACE抑制肽的IC50值為2.81 mg/mL。超聲波輔助酶解過程中超聲功率選擇0.5 W/mL、添加1 700 U/g堿性蛋白酶、酶解15 min時得到的芝麻餅粕ACE抑制肽的IC50值為2.96 mg/mL。微波預處理功率為1.33 W/mL、微波預處理5 min時得到的芝麻餅粕ACE抑制肽的IC50值為2.81 mg/mL。

超聲波 微波 酶解 芝麻餅粕 ACE抑制肽

目前常用的蛋白預處理方法，如高壓、加熱、高速剪切以及酸堿處理等方法存在成本高、對設備要求高、操作條件不易控制以及容易造成環(huán)境污染等缺點。超聲波作為一種物理強化手段，能在液體介質中形成微泡，當微泡破裂時伴隨能量的釋放，這些能量可改變物質組織結構、狀態(tài)、功能或加速這些改變的過程，從而改變蛋白質的生物活性、加工特性等[1－2]。因此，超聲波技術在食品領域中的應用越來越廣泛，超聲波作用對原料、酶活性的影響主要取決于超聲頻率、超聲功率及處理時間等參數。

微波使物質在微波場的作用下瞬時極化，從而產生鍵的振動、粒子間的摩擦和碰撞，使反應物內部膨脹，此時微波場的場能轉化為介質內的熱能，改變反應速率。同時微波引起的的非熱效應可以引起一些化學反應動力學的改變和加速化學反應速度的催化效應、引起聚合物分子鏈斷裂等生化效應和磁效應以及增加產物的手性選擇性等特點[3－4]。因此，微波技術可應用于蛋白處理，可使其具有原來所不具有的功能性質。

迄今為止，甚少有超聲波技術、微波技術應用于芝麻餅粕ACE抑制肽的研究的報道。本試驗研究超聲波預處理、超聲波輔助、微波預處理對芝麻餅粕制備ACE抑制肽時的影響，以期為超聲波技術和微波技術在蛋白酶解制備ACE抑制肽方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

芝麻餅粕（芝麻經水代法制備香油后的副產物，自然風干，貯存于通風干燥處）：徐州新沂吉順昌油脂科技有限公司。

堿性蛋白酶：無錫杰能科生物工程有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸：Sigma公司；馬尿酸標準品：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

LC－20AT高效液相色譜系統(tǒng)：日本島津公司；ZORBAX Eclipse XEB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）：Agilent公司；JY92－ⅡDN超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；CY－5D超聲波微生物促進生長儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；DISCOVER－SCLASS微波合成儀：美國培安公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 ACE抑制活性與半抑制濃度測定

參考吳瓊英等[5]研究的方法進行測定。準確吸取10μL樣品于1.5 mL離心管中，加入25μL ACE（1 U ACE溶于10 mL的 pH 8.3、0.1 mol/L的硼酸緩沖液中，該緩沖液含0.3 mol/L NaCl），37℃保溫5 min，隨后加入6.5 mmol/L HHL 40μL，37℃反應30 min，然后加入1 mol/L HCl85μL終止反應，所得反應液用于HPLC分析。用10μL pH 8.3硼酸緩沖液作空白對照試驗。

HPLC條件：ZORBAX－C18柱（4.6 mm×150 mm，填料粒徑 5μm）；檢測波長 228 nm；進樣量8μL；柱溫25℃；流動相為超純水 －乙腈（80∶20，各含0.5?三氟乙酸）；流速1.0 mL/min。計算公式如見式（1）。

式中：R為ACEI—ACE抑制率/%；A為空白對照組Hip的峰面積；B為添加ACE抑制肽組Hip的峰面積。

稱取一定質量樣品配成不同濃度的溶液，以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪成圓滑的曲線，從曲線中計算 IC50值[6]。

1.3.2 超聲波預處理芝麻餅粕試驗

稱取一定量的芝麻餅粕，加入適量的蒸餾水使其底物質量濃度為8.5%，攪拌至原料均勻分散于水中，在超聲波工作/間歇時間定為2 s/4 s的條件下，研究超聲功率（0、2、4、6、8、10 W/mL）、超聲時間（5、10、15、20、30 min）、加酶量（100、700、1 300、1 900、2 500 U/g）對其預處理效果的影響。超聲預處理結束后放入46℃的水浴鍋中，將溶液pH值調至8.88，加入2 000 U/g堿性蛋白酶，整個酶解過程中用1 mol/L NaOH溶液不斷調整使溶液的pH值不變。酶解24 min后，迅速將酶解液置入90℃水浴鍋中滅酶15 min。然后于5 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，測定ACE抑制活性。

1.3.3 超聲波輔助酶解試驗

稱取一定量的芝麻餅粕，加入適量的蒸餾水使其底物質量濃度為8.5%，攪拌至原料均勻分散于水中，然后放入46℃的水浴鍋中，將溶液pH值調至8.88，加入2 000 U/g堿性蛋白酶，酶解過程中添加超聲波，研究在頻率20 kHz，超聲波工作/間歇時間定為 2 s/4 s條件下，研究超聲功率（0.2、0.5、0.8 W/100 mL）和加酶量（100、900、1 700、2 500 U/g）對酶解過程的影響。整個酶解過程中用1 mol/L NaOH溶液不斷調整使溶液的pH值不變。酶解結束后，迅速將酶解液置入90℃水浴鍋中滅酶15 min，然后于5 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，冷藏以備ACE抑制活性測定。

1.3.4 微波預處理芝麻餅粕試驗

稱取8.5 g芝麻餅粕，加入30 mL蒸餾水，攪拌至原料均勻分散于水中，靜止10 min，研究微波時間（2、5、8 min）、微波功率（0.67、1.00、1.33、1.67、2.00 W/mL）對其預處理效果的研究。微波預處理結束后，添加70 mL的蒸餾水，放入46℃的水浴鍋中，將溶液pH值調至8.88，加入2 000 U/g堿性蛋白酶，整個酶解過程用1 mol/L NaOH溶液不斷調整使溶液的pH值不變。酶解結束后，迅速將酶解液置入90℃水浴鍋中滅酶15 min，然后于5 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，測定ACE抑制活性。

2 結果與討論

2.1 超聲波預處理芝麻餅粕制備ACE抑制肽

2.1.1 超聲功率對ACE抑制率的影響

超聲波工作/間歇時間定為2 s/4 s、超聲處理20 min，在pH 8.88，酶解溫度為46℃，底物質量濃度為8.5%，加酶量為2 000 U/g，酶解24 min的最優(yōu)條件下進行酶解，不同超聲功率預處理對芝麻餅粕酶解液ACEI影響如圖1所示。當超聲功率小于4 W/mL時呈上升趨勢，4 W/mL時達到最大值64.83%，相較于未加超聲波預處理時提高了11.87%。分析其原因可能是適當超聲功率使蛋白的空間結構發(fā)生變化，蛋白質內部的活性部位暴露更多，使這些部位對酶分子更加敏感；或者是超聲波處理能夠打斷自由氨基群和鄰近羧基群之間的聯系，阻止蛋白分子聚集；亦或是超聲功率變大，使空化泡崩潰所需的時間將變得更短，即單位時間內超聲產生的空化效應增多，從而有效提高底物與酶的結合，表現為 ACE抑制活性的提高[7－9]。

圖1 超聲功率對ACEI的影響

當超聲功率大于4W/mL時，ACEI緩慢下降，說明超聲功率過高不利于反應的進行。這可能是因為當超聲功率過大時，加速反應液的流動，從而物料停留在超聲場中的時間減少，影響溶出速率；或者是蛋白質的活性部位逐漸被破壞，不利于酶解過程中活性肽的繼續(xù)形成；亦或是具有ACE抑制活性的多肽片段中的水解位點被活化，過度酶解，影響最終酶解產物的抑制活性[10]。

2.1.2 超聲時間對ACE抑制率的影響

超聲波工作/間歇時間定為2 s/4 s、超聲功率選取4W/mL，在pH 8.88，酶解溫度為46℃，底物質量濃度為8.5%，加酶量為2 000 U/g，酶解24 min的最優(yōu)條件下進行酶解，不同超聲時間對芝麻餅粕酶解液ACEI的影響如圖2。由圖2可知，隨著超聲處理時間的延長，酶解液的ACEI逐漸升高，超聲10 min時達到最大值63.63%；進一步延長超聲預處理時間，ACEI反而緩慢下降。其原因可能是，在0～10 min，隨著超聲時間延長，反應體系所吸收的能量增多，使蛋白組織結構變得疏松，埋藏在蛋白質內部的活性部位暴露出來，酶更易作用于底物。然而，10 min以后ACEI降低的原因可能是蛋白質長期處于高溫高壓下，暴露在外的活性部位被破壞，酶未能作用于底物。

圖2 超聲時間對ACEI的影響

2.1.3 加酶量對ACE抑制率的影響

超聲波工作/間歇時間定為2 s/4 s、超聲功率選取4 W/mL、超聲預處理10 min，在 pH 8.88，酶解溫度為46℃，底物質量濃度為8.5%，加酶量為2 000 U/g，酶解24 min的最優(yōu)條件下進行酶解，改變加酶量時ACEI的變化如圖3所示。ACEI隨著酶添加量增加而遞增，并且與未加超聲預處理的常規(guī)酶解時相比ACEI有所提高。表明超聲波對蛋白質的較強物理作用，使酶與底物接觸幾率增大，酶解速率變大，致使ACE抑制肽更快地分離出來，表現為高ACE抑制活性。酶添加量大于1 300 U/g之后其變化較緩慢，說明酶分子過于飽和，部分酶分子沒有機會與底物結合，造成酶的浪費。

超聲預處理的芝麻餅粕制備ACE抑制肽時，相較于未加超聲、加酶量為2 000 U/g時的 ACEI（57.95%），使用更少量的酶（1 300 U/g）的同時提高了ACE抑制活性（63.45%）。因此，超聲預處理不僅可以提高ACE抑制活性，同時也提高了酶的使用效率。

圖3 加酶量對ACEI的影響

2.2 超聲波輔助酶解制備芝麻餅粕ACE抑制肽

2.2.1 超聲功率對ACE抑制率的影響

酶解條件選取pH 8.88，酶解溫度為46℃，底物質量濃度為8.5%，加酶量為2 000 U/g，酶解24 min的最優(yōu)條件，同時酶解過程中添加超聲波，超聲頻率定為20 kHz，不同超聲功率對ACEI的影響見圖4。ACE抑制活性均隨著超聲輔助酶解時間的延長先逐漸增大，再趨緩或下降。在酶解反應的初始階段，超聲功率為0.2 W/mL時ACEI變化最快，10 min時就已達到此功率下的最大值；繼續(xù)延長超聲輔助酶解時間，其ACE抑制活性緩慢下降。當超聲功率為0.5W/mL時，ACEI最大，反應進行5 min時其ACEI就已達到57.25%，與未加超聲時最大值接近；ACEI繼續(xù)增大至酶解20 min時的62.62%之后有所下降。當超聲功率為0.8W/mL時，在反應初始階段較未加超聲時大，酶解15 min達到最大值，繼續(xù)進行酶解時與空白試驗結果相似。

在超聲輔助酶解的初始階段，ACEI相較于空白試驗在短時間內迅速提高是因為短時間的超聲輔助酶解產生的空化作用隨時間的延長而增強，這種作用能夠改變酶的分子構象，提高酶的活性，同時也加強了介質與酶之間的傳質擴散過程。但是超聲功率過大、超聲輔助酶解時間過長，反應體系所吸收的能量也增大，增大到足夠破壞蛋白酶的分子構象，將會抑制反應的進一步進行[11]。

賈俊強等[12]通過超聲波處理小麥胚芽球蛋白試驗得出在低功率條件下超聲波使酶活增大，而在功率較高時酶活下降的結論。也有研究表明，低功率超聲波可增加反應系統(tǒng)內流體的循環(huán)速度，強化傳質，但隨著功率增大，超聲波的劇烈刺激以及局部溫度瞬時升高會影響酶的結構，進而改變酶活力[13]。

圖4 超聲功率對ACEI的影響

2.2.2 加酶量對ACE抑制率的影響

近年的研究表明，超聲波除能夠加速反應的進行外還可節(jié)省酶的使用量。因此本試驗選取pH 8.88，酶解溫度為46℃，底物質量濃度為8.5%，加酶量為2 000 U/g，酶解24 min的最優(yōu)酶解條件，同時酶解過程中添加超聲波，超聲頻率定為20 kHz，研究超聲波輔助酶解時不同加酶量對ACEI的影響，其影響見圖5。隨著加酶量的增大，其ACEI迅速增大；達到最大值后繼續(xù)加大酶的使用量，其ACEI趨于穩(wěn)定。同時也可看出，盡管堿性蛋白酶的添加量不同，但其ACEI在反應初始階段均隨著反應的進行而增大；繼續(xù)延長反應時間，反而ACE抑制活性降低。

在加酶量100 U/g時其抑制率相較于其他加酶量時明顯低；900 U/g時，ACE有明顯的提高；而1 700 U/g和2 500 U/g的添加量，在酶解反應的初始15 min內，ACE抑制效果幾乎一致，沒有明顯的差異，最大值分別為61.41%和62.55%；超聲輔助酶解超過15 min后，其ACE抑制活性變化有所區(qū)別，1 700 U/g時其活性迅速下降，而2 500 U/g時下降趨勢相對較緩慢。20 min之后，900 U/g達到最大值，超過1 700 U/g時的抑制活性，稍低于2 500 U/g時的抑制活性。

分析原因可能是超聲波的機械作用和空化作用增加了反應體系的能量，使底物分子與酶分子的運動加強，促進酶與底物表面的吸附與脫落，提高酶與底物的反應效率。或者是酶的活性部位在超聲波的作用下迅速被活化，酶的活化效率提高，從而促進酶解反應的進行[14－16]。

圖5 加酶量對ACEI的影響

2.3 微波預處理芝麻餅粕制備ACE抑制肽

2.3.1 微波時間對ACE抑制率的影響

微波場誘導蛋白分子產生極化現象，致使分子間頻繁碰撞而使體系的溫度上升，使維持蛋白空間結構的非共價鍵被破壞，內部的疏水殘基暴露在蛋白表面[17－18]。尤其是在堿性pH范圍內，蛋白質表面具有較多的負電荷，受到微波場的強烈振蕩，芝麻餅粕蛋白的結構更容易被破壞[19]。

微波處理時間的長短對酶解反應有較大影響，處理時間短，其微波效應尚未起到作用；而時間過長，反應體系內積聚過多的熱量，影響反應的進行，同時也影響產物的功能特性。

圖6 微波時間對ACEI的影響

微波處理技術的最大特點是瞬間加熱，使得酶促反應在短時間內迅速完成。微波功率定為1.67 W/mL，在pH 8.88，酶解溫度為46℃，底物質量濃度為8.5%，加酶量為2 000 U/g，酶解24 min的最優(yōu)條件下進行酶解，考察不同微波預處理時間對ACEI的影響，其結果如圖6所示。由圖6可知，微波預處理促進芝麻餅粕酶解產生更多具有ACE抑制活性的物質。微波預處理2 min、酶解0～7 min時，ACEI較空白組有所下降。可能是微波產生的能量使芝麻餅粕組織膨脹，其能量又不足改變蛋白質結構，導致傳質受阻，降低了后期底物與酶結合幾率。但是經過長時間的酶解，ACE抑制活性將隨著酶解反應的進行而提高，可能是隨著酶解反應的進行而積聚的熱量貢獻于蛋白質結構的改變，促進酶解反應。

繼續(xù)延長微波處理時間至5 min時酶解液的ACEI達到最大值。5 min的微波處理縮短了反應體系達到ACE抑制活性最大化的時間。這可能是微波作用下蛋白質所吸收的能量使蛋白質分散更加均勻，同時使蛋白質變性后暴露出更多的酶切位點，從而加速酶解反應[20]。

微波處理時間超過5 min，ACEI迅速下降，并且不同酶解時間處理的樣品表現出相似的ACE抑制活性?？赡苁菢O化的蛋白分子之間通過非共價鍵重新形成蛋白聚集體，阻礙后期的酶解反應；或者是反應體系內積聚的熱量過多，酶的活性基團遭破壞至失活，從而蛋白酶無法正常作用于酶切位點，導致酶解反應不能順利進行甚至終止[21－24]。

2.3.2 微波功率對ACE抑制率的影響

微波預處理時間定為5 min，在pH 8.88，酶解溫度為46℃，底物質量濃度為8.5%，加酶量為2 000 U/g，酶解24 min的最優(yōu)條件下進行酶解，考察不同微波功率對ACEI的影響，其結果如圖7所示。隨著微波功率的增大，ACE抑制活性逐漸增強，當微波功率為1.33～1.67 W/mL時，酶解液表現出相似的ACE抑制活性，表現出高ACE抑制活性。

圖7 微波功率對ACEI的影響

當微波功率為0.67～1.00 W/mL時，蛋白質分子無法充分地受熱并作極性運動，因而微波對酶解反應尚未起到促進作用。微波功率適當時，反應體系的溫度在短時間內迅速升高至反應所需的溫度，分子運動加快，使蛋白質變性而暴露更多的活性部位，提高與酶結合反應的效率。當微波功率過大（2 W/mL）時，雖然在反應初始階段酶解速率大，迅速達到平衡點，但ACE抑制活性隨著酶解時間的延長變化不明顯。這可能是因為在較高的功率下，溫度升高過快，蛋白質中與酶作用的活性基團容易遭破壞；也有可能是隨著溫度升高，蛋白質凝聚而阻礙酶解反應的進行。

另外，從圖6～圖7中的芝麻餅粕只經過微波預處理、不進行酶解的空白組比較可看出ACE抑制活性主要是通過堿性蛋白酶的酶解作用得到提高。李菊芳[25]研究微波輔助菜籽蛋白水解的研究中也發(fā)現，對菜籽餅粕微波預處理是必要的，但是水解不是由微波直接輻射產生，而主要是由蛋白酶的作用產生，與本試驗得到的結論一致。

3 驗證試驗

通過3種不同處理方式的單因素試驗，選取各因素的最佳水平，進行驗證試驗，試驗得到不同處理方式的最佳條件如下表1。

表1 不同處理方式對ACE抑制率的影響

不同處理方式得到的效果好于常規(guī)酶解，酶解液的ACE抑制活性有不同程度的提高。超聲波預處理、超聲輔助酶解和微波預處理均有一定的效果，IC50值從常規(guī)酶解時的3.03 mg/mL降低為2.81、2.96、2.81 mg/mL，分別降低了 7.39%、2.28%和7.33%。說明超聲波預處理、超聲輔助酶解和微波預處理均優(yōu)于常規(guī)酶解。其中超聲預處理效果好于超聲輔助酶解效果，這與羅曉慧[26]研究超聲波技術對珠蚌抗氧化肽制備中得到的結果一致。

Elias等[27]利用超聲波對茶籽粕蛋白進行預處理，發(fā)現超聲波預處理使茶籽粕蛋白構象發(fā)生變化，分子發(fā)生伸展，酪氨酸、亮氨酸等內部氨基酸充分暴露出來，而這些氨基酸對抗氧化肽活性和穩(wěn)定性的提高具有重要的作用。本試驗中ACE抑制活性的提高是否與超聲波或微波促使ACE抑制活性相關的氨基酸的釋放有關，有待進一步研究。

4 結論

通過試驗建立了酶法制備芝麻餅粕ACE抑制肽快速高效的方法，得到了超聲波預處理、超聲波輔助酶解、微波預處理對酶法制備芝麻餅粕ACE抑制肽的最優(yōu)條件。

4.1 超聲波預處理功率為4 W/mL、預處理10 min、添加1 300 U/g堿性蛋白酶時得到的芝麻餅粕ACE抑制肽的IC50值為2.81 mg/mL。

4.2 超聲波輔助酶解過程超聲功率選擇0.5W/mL、添加1 700 U/g堿性蛋白酶、酶解15 min時得到的芝麻餅粕ACE抑制肽的IC50值為2.96 mg/mL。

4.3 微波預處理功率為1.33 W/mL，微波預處理5 min時得到的芝麻餅粕 ACE抑制肽的 IC50值為2.81 mg/mL。

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The Application of Ultrasonic and Microwave Technology in ACE Inhibitory Peptide Preparation of Sesame Cake

Wang Zhenbin Chen Bingbing Liu Jiayou Ma Haile Jiang Meihua Wang Lin Ding Qingzhi Qu Wenjuan

（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

In order to explore the application of ultrasonic and microwave technology in ACE inhibitory peptide preparation of sesame cake，using ultrasonic and microwave on sesame cake pretreatment respectively，ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis，investigating the effects of ultrasonic power，ultrasonic time，microwave power，microwave time，enzyme dosage inhibition rate of ACE.The results show that：the ultrasonic pretreatment power is 4 W/mL，with pretreatmentof10min，pretreatmentwith 1 300 U/g alkaline protease of sesame cake ACE IC50value is 2.81 mg/mL.Ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis process of ultrasonic power is 0.5 W/mL，add 1 700 U/g alkaline protease，enzyme solution is obtained at15 min，sesame cake ACE inhibitory peptide of IC50value is 2.96 mg/mL.Microwave power is 1.33 W/mL，microwave pretreatment at 5 min inhibitory peptides from sesame cake ACE IC50value is 2.81 mg/mL.

ultrasonic wave，microwave，enzymolysis，sesame cake，ACE inhibitory peptide

TS210.3

A

1003－0174（2015）10－0100－07

蘇北科技發(fā)展計劃（BC2012421），江蘇大學大學生科研立項（12A018）

2014－02－20

王振斌，男，1975年出生，副教授，農產品生物加工技術

馬海樂，男，1963年出生，教授，博士生導師，天然產物分離及應用