江秀紅 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心 福州 350003

四環(huán)素類抗生素（TCs）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗菌藥，主要有四環(huán)素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、多西環(huán)素（DOTC）和美他霉素（METC）等[1]，在畜禽生產(chǎn)中被廣泛用于藥物添加劑，用于防治腸道感染和促生長，容易誘導(dǎo)耐藥菌株和導(dǎo)致食品殘留。四環(huán)素、土霉素和金霉素是我國應(yīng)用最廣、應(yīng)用時(shí)間最長的動(dòng)物保健性抗生素，一些不法分子為了經(jīng)濟(jì)效益，常濫用這類藥物，致使在動(dòng)物性食品中大量殘留，不僅危害人體健康，而且更為嚴(yán)重的是畜禽產(chǎn)品中殘留高濃度的土霉素、金霉素和四環(huán)素容易誘導(dǎo)各種致病菌產(chǎn)生耐藥性，不利于對(duì)人類和畜禽類疾病的治療。歐盟及我國均規(guī)定動(dòng)物組織中四環(huán)素類抗生素的最大殘留限量為：腎0.6 mg/kg、肝 0.3 mg/kg、肌肉 0.1 mg/kg[2]。

目前用于該種藥物的檢測方法有：微生物法、薄層色譜法、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[3]。已有的方法存在靈敏度不高、前處理繁瑣或重現(xiàn)性不好等問題，很難滿足對(duì)藥物殘留的確證檢測[4]。本方法選用鴨肌肉組織為分析對(duì)象，建立了一種檢測四環(huán)素類藥物的快速、簡便、靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS-MS）方法，可以滿足當(dāng)前該類藥物的殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Waters2695 Quattro micro液質(zhì)聯(lián)用儀（美國WATERS公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；固相萃取裝置（美國Supe1co公司）；旋轉(zhuǎn)混合器（IKA公司）；PL203電子天平（瑞士Mett1er-to1edo公司）；氮吹儀（美國 OA-SYS公司）；酸度計(jì) PB-21（美國Orion公司）；Sep-pak C18 6CC萃取小柱（500 mg）。

四環(huán)素、土霉素和金霉素的鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度＞99.5%；甲醇、乙腈為默克公司的色譜純；甲酸為美國ACS恩科公司的色譜純；檸檬酸（含一個(gè)結(jié)晶水）、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉均為分析純；所用水為屈臣氏瓶裝純凈水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 分別取鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素和鹽酸金霉素對(duì)照品適量，精密稱定。按四環(huán)素、土霉素和金霉素計(jì)，用甲醇溶解并稀釋成濃度均為1 mg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置-20℃冰箱中保存。

1.2.2 四環(huán)素、土霉素和金霉素工作液 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇-水（3:7，V/V）溶液稀釋成適宜濃度的四環(huán)素、土霉素和金霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 McI1vaine-Na2EDTA緩沖液 分別取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mo1/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至4.0±0.5，加水稀釋至1 000 mL，即得。

1.2.4 樣品前處理方法 稱取均質(zhì)的鴨肌肉組織2.0 g，置于50 mL離心管中，加入McI1vaine-Na2EDTA緩沖液8 mL，渦旋充分混勻，10 000 r/min離心10 min（溫度為4℃），取上清液于另一離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液，經(jīng)快速濾紙過濾后備用。Sep-pak C18固相萃取柱依次用甲醇5 mL、水5 mL預(yù)洗。取備用液8 mL過柱，用3 mL10%甲醇水溶液淋洗，減壓抽干。用5 mL5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑囟鹊陀?0℃）。最后用甲醇-水 （3:7）1.0 mL溶解殘留物，過濾膜后作為試樣溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3 色譜條件 色譜柱：Xbridge C18 2.1*150 mm，粒徑5μm。流動(dòng)相A為0.3%甲酸乙腈溶液；B為0.3%甲酸水溶液。柱溫：35℃，進(jìn)樣體積20μL，流速：0.2 mL/min。流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧正離子檢測；毛細(xì)管電壓：3.8 kV；錐孔電壓：25 V；離子源溫度 110℃；霧化溫度：350℃。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 四環(huán)素、土霉素、金霉素質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL 置于 10 mL 容量瓶，稀釋成含四環(huán)素、 土霉素和金霉素分別為 5、 10、20、50、100、200、400 ng/mL 的溶液，見表 3。

2.2 方法的檢出限和定量限 將標(biāo)準(zhǔn)溶液用樣品空白基質(zhì)稀釋后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20μL，以信噪比為3倍時(shí)的溶液濃度為檢出限，由此得出四環(huán)素、土霉素、金霉素的檢出限 （LOD）分別為 5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL，結(jié)果見表3。以信噪比為10倍的溶液溶度為定量限，稱樣量為2.0 g，前處理后定容至1.0 mL，則四環(huán)素、土霉素、金霉素的定量限均為20 ng/mL。

表3 方法的線性范圍、檢出限和回歸方程

2.3 方法的精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取經(jīng)檢測四環(huán)素、土霉素、金霉素含量低于檢測限度的鴨肉，分別添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，相當(dāng)于50、100和200 ug/kg （即 1/2的 MRLVDs、MRLVDs和 2倍 的MRLVDs）3個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度5組平行樣，按1.2.2所述方法提取制備后進(jìn)行處理，進(jìn)行回收率試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)，回收率均在80.6%～106.3%，RSD均在0.6%～4.2%，符合方法學(xué)要求，結(jié)果見表4。

3 結(jié) 論

本研究建立了鴨肉中四環(huán)素類抗生素的定性和定量方法。樣品在4℃條件下高速冷凍離心，可以較好地去除油脂類雜質(zhì)，同時(shí)，收集液用快速濾紙過濾，極大地加快了固相萃取小柱的凈化洗脫速度，整個(gè)前處理過程具有分離度高、快速的特點(diǎn)，最后用甲醇-水溶解殘余物，可以確保樣品溶液的穩(wěn)定性和檢測的靈敏度。

采用該方法，檢測了南方櫻桃谷肉鴨生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)集成與示范項(xiàng)目的鴨肉192批次，結(jié)果均未檢測出該類藥物，說明該方法可用于實(shí)際樣品的測定。

表4 精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=5）

[1]滑靜,王建立,張淑萍.動(dòng)物性食品中四環(huán)素類藥物殘留的檢測方法[J].藥物檢測,2004,21（7）:26-33.

[2]李俊鎖,邱月明,王超.獸藥殘留分析[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2002:365.

[3]劉艷華,張純萍,門立強(qiáng),等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肌肉組織中的四環(huán)素類藥物殘留 [J].色譜,2005,24（2）:171-173.

[4]蔡英華,薛毅,張玥,等.UPLC-MS/MS法測定動(dòng)物源性食品中四個(gè)四環(huán)素類藥物和10個(gè)受體激動(dòng)劑類藥物殘留[J].藥物分析雜志,2014,34（7）:1223-1230.