韓長志，李瑞強

(西南林業(yè)大學林學院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南 昆明650224)

球花石楠Photinia glomerata Rehd．et Wils．作為云南省重要的鄉(xiāng)土樹種，已經(jīng)廣泛用于城市綠化和景觀設(shè)計，但是近年來球花石楠黑斑病在昆明地區(qū)發(fā)病呈逐漸嚴重趨勢，成為影響城市綠化的重要因素之一。作者通過前期對球花石楠黑斑病的病害調(diào)查以及病原菌分離、鑒定，明確該病害是由鏈格孢屬Alternaria Nees真菌引起［1］。本研究從不同培養(yǎng)基、溫度、pH值、光照、通氣條件以及不同碳源、氮源等方面，對球花石楠黑斑病菌的生物學特性進行研究，以期解釋鏈格孢屬真菌寄主范圍較廣、分布較廣的原因，也為進一步研究該病菌致病原因和防治提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種球花石楠黑斑病菌分離于西南林業(yè)大學校園內(nèi)的球花石楠葉片，將獲得的純培養(yǎng)菌株保存在試管斜面于4℃冰箱中。菌種保藏于西南林業(yè)大學植物病理學教研室，菌種編號QHSN-1。

1.2 病原菌生物學特性研究

選擇常規(guī)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)病菌。即，用打孔器(直徑7 mm)將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d(28℃恒溫培養(yǎng)箱、黑暗條件)的病原菌菌落打成菌絲塊接種PDA培養(yǎng)基上(不同的培養(yǎng)基、碳源和氮源測試除外)，28℃恒溫培養(yǎng)(不同溫度測試除外)，觀察和描述病菌的菌落特征，用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計分析病原菌生長差異。

1.2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 共5種培養(yǎng)基，每種處理5個重復(fù)，培養(yǎng)5 d。

①馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL;②馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA):馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL;③燕麥培養(yǎng)基(OA):燕麥片30 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL;④清水洋菜培養(yǎng)基(WA):瓊脂粉20 g、水1000 mL;⑤玉米粉培養(yǎng)基(CMM):玉米粉40 g、蔗糖10 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 將病原菌分別置于5，11，22，28，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.3 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 在無菌條件下用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)滅菌的PDA培養(yǎng)基pH值，設(shè)pH值為3，4，5，6，7，8，9，10，11等9個梯度，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.4 不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響

不同光照條件采用光照4 d、黑暗4 d和光照黑暗各2 d(光暗交替)3種處理，黑暗條件用有蓋黑色紙筒罩住。每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)4 d。

1.2.5 不同通氣條件對病原菌菌絲生長的影響

采用培養(yǎng)皿Parafilm膠帶封口和不封口2種方法進行。每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.6 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加碳源為對照，用含有相當量碳的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等多種碳源代替查氏培養(yǎng)基中蔗糖，做成不同碳源的固體培養(yǎng)基，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.7 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加氮源為對照，用含有相當?shù)南跛徜@、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸等多種氮源代替查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，做成不同氮源的固體培養(yǎng)基，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析用Excel 2007對原始數(shù)據(jù)進行分析、處理和作圖。所有圖形中的正負偏差均表示標準誤(SE)，利用Excel中的程序SE=STDEV(range of values)/SQRT(number)進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響球花石楠黑斑病菌除在WA培養(yǎng)基上生長不好外，在其他培養(yǎng)基上都生長較好，尤以在PSA、PDA上生長最快，且菌絲最為密集(圖1)。病原菌在不同培養(yǎng)基上所形成的菌落顏色不同，PSA、PDA培養(yǎng)基上的菌落顏色為灰色至黑暗色，而CMM、OA培養(yǎng)基上的菌落則灰色至紅褐色(表1)。

圖1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長速率的影響

表1 不同培養(yǎng)基上的病原菌菌落形態(tài)特征

2.2 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響從圖2可以看到，在設(shè)置的11，22，28℃條件下，菌絲均能正常生長，尤以28℃時菌絲生長最快;而在5，37℃條件下，病原菌菌絲不能正常生長，將其轉(zhuǎn)移至28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)后，菌絲又能恢復(fù)生長，說明5℃的低溫和37℃高溫并未將該病原菌殺死，只是抑制了生長。因此，球花石楠黑斑病病菌生長的最適溫度為28℃。后續(xù)研究選擇該溫度對病菌進行恒溫培養(yǎng)。

2.3 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響在pH 4～11時病原菌都能生長，尤以pH 6～9時病原菌生長較快，其中，pH 8時菌絲生長速率最快，其次為6，7;病原菌在極酸條件(pH為3，4，5)下不能生長，或受到抑制(圖3)?？梢?，病原菌菌絲適宜在中性至偏堿性環(huán)境生長，極酸環(huán)境不利生長。

圖2 不同溫度對病原菌菌絲生長速率的影響

圖3 不同p H對病原菌菌絲生長速率的影響

2.4 不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響 4 d全部光照、4 d全部黑暗以及2 d光照/2 d黑暗(光暗交替)3種光照條件下菌落生長速率僅有較小的差異(圖4)，培養(yǎng)性狀略有差異，在4 d全部光照條件下病原菌菌絲最密集，菌落顏色最深。

圖4 不同光照條件對病原菌菌絲生長速率的影響

2.5 不同通氣條件對病原菌菌絲生長的影響利用parafilm封口膜封口的條件下，菌絲生長情況好于不封口的(10．8 mm/d＞10．5 mm/d)，生長速度更快，同時，用parafilm封口可以較好地防止病原菌受到污染，有利于后續(xù)試驗的開展。

2.6 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 病原菌在所供試的8種含有不同碳源的培養(yǎng)基上都能快速生長，生長速率差異較小;在不加碳源為對照的培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)較為稀疏，且顏色很淺(圖5)。

圖5 不同碳源對病原菌生長速率的影響

上述結(jié)果表明，病原菌的正常生長與碳源關(guān)系非常密切，其可利用的碳源種類較為豐富，尤以麥芽糖最佳。

2.7 不同氮源對病原菌生長的影響病原菌在以蛋白胨、甘氨酸和硝酸鈉作為氮源的條件下生長速率較快，且菌絲形態(tài)較為密集、菌落較厚，而在不加氮源為對照的培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)極為稀疏，且顏色極淺;另外，以磷酸二氫銨、硫酸銨作為氮源時，病原菌生長受到抑制(圖6)。

圖6 不同氮源對病原菌菌絲生長速率的影響

3 結(jié)論與討論

球花石楠的樹冠圓整、葉片光綠，以及在不同季節(jié)所具有的觀賞價值使其廣泛應(yīng)用于城市園林綠化中。目前，對于球花石楠的研究涉及組織離體培養(yǎng)［2］、種子育苗［3］以及脅迫條件下體內(nèi)生理特性［4］等方面，對其病害的報道有黑斑病［1］、銹?。?］等。

本研究以球花石楠黑斑病菌為研究對象，通過不同培養(yǎng)基、溫度、pH、光照、通氣狀況、碳源、氮源等條件對菌絲生長的影響研究表明，該病原菌生長最適條件為PDA，28℃，封閉，pH 8，碳源為麥芽糖，氮源為蛋白胨，其酸堿度的適應(yīng)范圍較廣。同時，為了更好地研究光照條件對病菌菌絲生長的影響，本研究對光照條件的設(shè)置并未使用常規(guī)的8 h光照/16 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗以及16 h光照/8 h黑暗，而是將光照、黑暗條件進行極端化處理，設(shè)置4 d全部光照、4 d全部黑暗以及2 d光照/2 d黑暗(光暗交替)3種處理，明確該病菌可以較好地利用不同的光照條件。上述結(jié)果對于解釋該菌侵染寄主范圍較廣、分布較廣的原因，也為進一步開展對病原菌的侵染循環(huán)、發(fā)生規(guī)律以及防治方法等方面的研究奠定重要的理論基礎(chǔ)。

此外，本研究明確球花石楠黑斑病菌的正常生長與氮源關(guān)系非常密切，其可利用的氮源種類較為豐富，尤以蛋白胨最佳。該病原菌不能利用某些氮源，推測其體內(nèi)可能缺少相關(guān)酶類，這為進一步采用這些氮源作為營養(yǎng)劑來防治病原菌提供了理論依據(jù)。

［1］ 韓長志，李瑞強．球花石楠黑斑病病害調(diào)查及病原鑒定初報［J］．中國森林病蟲，2014(5):8-9．

［2］ 林萍，普曉蘭．球花石楠離體培養(yǎng)及快速繁殖研究［J］．植物研究，2003(3):280-284．

［3］ 白平．球花石楠種子育苗技術(shù)［J］．福建林業(yè)科技，2011(1):86-88．

［4］ 黃曉霞，黃大韌，楊自云，等．土壤干旱與鹽脅迫對球花石楠幼苗生理特性的影響［J］．北方園藝，2010(21):87-89．

［5］ 蔡燦，伍建榕．球花石楠銹病病原物的初步研究［J］．北方園藝，2008(1):208-210．