張桂芬， 王福蓮， 呂志創(chuàng)， 黃　聰， 李詠軍， 郭建英， 李傳仁， 萬(wàn)方浩,4*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 2農(nóng)業(yè)部外來(lái)

入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 100193； 3長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025;

4青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266109

?

柑橘大實(shí)蠅生物、生態(tài)學(xué)及輻照不育技術(shù)最新研究進(jìn)展

張桂芬1,2*， 王福蓮3， 呂志創(chuàng)1,2， 黃聰3， 李詠軍1， 郭建英1,2， 李傳仁3， 萬(wàn)方浩1,2,4*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2農(nóng)業(yè)部外來(lái)

入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 100193；3長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025;

4青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266109

摘要:柑橘大實(shí)蠅是柑橘類(lèi)果樹(shù)的一種重要害蟲(chóng)，近幾年在我國(guó)柑橘種植區(qū)的危害呈上升趨勢(shì)，給柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失。本文概述了環(huán)境因素包括溫度、光周期、營(yíng)養(yǎng)狀況(饑渴)以及水淹對(duì)柑橘大實(shí)蠅生物學(xué)特性和成蟲(chóng)行為的影響，柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)人工飼養(yǎng)技術(shù)參數(shù)，柑橘大實(shí)蠅蛹滯育機(jī)制，輻照不育關(guān)鍵技術(shù)包括最佳輻照劑量和輻照時(shí)期，及其在湖北柑橘園柑橘大實(shí)蠅防控中的應(yīng)用與示范情況等，并指出了尚需進(jìn)一步開(kāi)展的研究?jī)?nèi)容。

關(guān)鍵詞:柑橘大實(shí)蠅； 輻照不育技術(shù)； 人工飼料； 滯育機(jī)制

Research progress on the biology, ecology and the application

of sterile insect technique onBactroceraminax(Enderlein)

Gui-fen ZHANG1,2*, Fu-lian WANG3, Zhi-chuang Lü1,2, Cong HUANG3, Yong-jun LI1,

柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax(Enderlein)屬雙翅目實(shí)蠅科離腹寡毛實(shí)蠅屬。該種實(shí)蠅已在我國(guó)廣西、貴州、湖北、湖南、江蘇、江西、陜西、四川、云南、河南等多個(gè)省份廣泛分布；此外，在亞洲的其他國(guó)家如不丹、印度、錫金等也有分布，是柑橘類(lèi)植物上的一種重要害蟲(chóng)，也是國(guó)內(nèi)外重要的檢疫性害蟲(chóng)(EPPO/CABI,1997)。柑橘大實(shí)蠅以幼蟲(chóng)在柑橘類(lèi)植物的果實(shí)內(nèi)蛀食為害，初孵幼蟲(chóng)取食囊汁，隨著齡期的增大幼蟲(chóng)食量逐漸增多，并在果實(shí)內(nèi)縱橫竄食，吸食果肉；被害果實(shí)多具有未熟先黃或黃中帶紅的色斑, 提早脫落(汪興鑒和羅祿怡,1995)。通常，柑橘大實(shí)蠅的幼蟲(chóng)蛀果率為5%~20%，局部地區(qū)高達(dá)50%以上，嚴(yán)重受害的地塊甚至絕收(聶家云等,1999; 汪興鑒和羅祿怡,1995; 余仕長(zhǎng)等,1996; Dorjietal.,2006; EPPO/CABI,1997)。柑橘大實(shí)蠅一年發(fā)生一代，成蟲(chóng)于4月下旬開(kāi)始羽化出土，產(chǎn)卵盛期為6月中旬至7月上旬，8月中旬至9月初為幼蟲(chóng)發(fā)生盛期，10月上中旬幼蟲(chóng)逐漸老熟，從被害果中鉆出并入土化蛹(楊永政等,2008)。

早在20世紀(jì)40年代末至50年代初，柑橘大實(shí)蠅即嚴(yán)重危害柑橘果實(shí)，后通過(guò)發(fā)動(dòng)群眾采用以處理“三果”(即卵果、蟲(chóng)蛀果以及有蟲(chóng)落果)為主要措施的大范圍區(qū)域聯(lián)防，取得顯著的防治效果，使果實(shí)受害率從以往的50%~100%下降到不足1%(汪興鑒和羅祿怡,1995; 吳志清,1958)；80年代至90年代，相關(guān)科研人員開(kāi)展了以水解乳蛋白和啤酒酵母為主要餌劑成分的柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)誘殺研究，取得了明顯的防治效果(汪興鑒和羅祿怡,1995)；以60Co-γ射線為輻照源的昆蟲(chóng)不育技術(shù)，在貴州惠水縣中聯(lián)果場(chǎng)連續(xù)釋放應(yīng)用2年，使蛆果率由常年的6%~8%下降為0.005%，防除效果非常顯著(王華篙等,1990)。然而，近年來(lái)柑橘大實(shí)蠅危害又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。因此，本文對(duì)近5年來(lái)柑橘大實(shí)蠅生物學(xué)和生態(tài)學(xué)及其輻照不育技術(shù)的研究進(jìn)行介紹,以為其有效防控提供參考。

1　環(huán)境因素對(duì)柑橘大實(shí)蠅生物學(xué)特性的影響

1.1溫度和光周期對(duì)柑橘大實(shí)蠅化蛹整齊度的影響

藺偉偉等(2012)研究表明，10~15 ℃對(duì)柑橘大實(shí)蠅幼蟲(chóng)的化蛹最為有利，3 d之內(nèi)全部化蛹；溫度過(guò)高或過(guò)低，均會(huì)延長(zhǎng)化蛹?xì)v期。當(dāng)溫度為10 ℃時(shí)，8L∶16D的光周期最利于其化蛹，2 d之內(nèi)全部化蛹。因此，在秋季當(dāng)溫度達(dá)到10 ℃時(shí)，短日照是誘導(dǎo)其化蛹的主要因素。

1.2高、低溫脅迫對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)存活及幼蟲(chóng)孵化的影響

1.2.1短時(shí)高溫暴露黃聰(2015)研究了37~45 ℃高溫對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)存活以及39~45 ℃對(duì)幼蟲(chóng)孵化的影響。結(jié)果表明，當(dāng)處理時(shí)間為20、40、60 min時(shí)，柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)擊倒溫度LT50分別為39.3、39.0、38.6 ℃，LT90分別為40.3、40.5、40.4 ℃;致死溫度LT50分別為43.5、42.4、40.7 ℃，LT90分別為44.7、43.0、42.4 ℃。隨著脅迫強(qiáng)度的增大，短時(shí)高溫暴露對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)的性比有顯著影響，在41 ℃下暴露60 min或43 ℃下暴露40 min，雌性比例顯著降低；此外，雄性成蟲(chóng)的耐熱能力比雌蟲(chóng)強(qiáng)。高溫對(duì)柑橘大實(shí)蠅幼蟲(chóng)孵化有顯著影響，當(dāng)以39~45 ℃的高溫分別處理卵1~4 h，幼蟲(chóng)孵化率顯著降低。

1.2.2短時(shí)低溫脅迫將10 ℃冷藏29 d后的蛹取出于室內(nèi)自然條件下發(fā)育至1級(jí)蛹高峰期(95%)、2~3級(jí)蛹高峰期(70%)、4級(jí)蛹高峰期(70%)，分別于10、15、20 ℃下處理2、4、8 h。結(jié)果顯示，當(dāng)在10 ℃下處理1級(jí)蛹2 h時(shí)，成蟲(chóng)羽化率略有下降，但隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)(4、8 h)成蟲(chóng)羽化率與對(duì)照間沒(méi)有明顯差異；當(dāng)處理溫度提高至15和20 ℃，1級(jí)蛹的成蟲(chóng)羽化率提高了43.2%~56.3%，且差異顯著。同時(shí)，研究結(jié)果還表明，低溫儲(chǔ)藏可使成蟲(chóng)羽化高峰期延遲，且延遲時(shí)間與低溫儲(chǔ)藏時(shí)間的長(zhǎng)短呈正相關(guān)；此外，低溫儲(chǔ)藏40 d以上，對(duì)成蟲(chóng)羽化率具有明顯的不良影響(黃聰,2015)。

1.2.3短時(shí)亞致死低溫脅迫選取個(gè)體大小基本一致的同一批蛹，埋入含水量為10%~15%的細(xì)沙中，埋蛹深度為3~5 cm，然后置于-10 ℃冰箱中分別處理0.5、1、2、4、8、16、32 h后取出，于室溫下保存，定期噴水保持濕度；對(duì)照不經(jīng)過(guò)低溫處理，直接置于室溫下。結(jié)果顯示，在-10 ℃下脅迫0.5~8 h，成蟲(chóng)羽化的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)與對(duì)照相仿，羽化高峰期集中在5月14~23日。但是，經(jīng)亞致死低溫處理后的蛹，其成蟲(chóng)羽化高峰出現(xiàn)的時(shí)間較對(duì)照推遲。此外，將柑橘大實(shí)蠅的蛹在-10 ℃下處理16和32 h，成蟲(chóng)羽化始期推遲了3~6 d，且羽化進(jìn)程加快，羽化率(約10%)較對(duì)照以及其他處理明顯降低(黃聰,2015)。

1.3　饑渴對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)的影響

1.3.1對(duì)成蟲(chóng)壽命的影響從羽化當(dāng)日開(kāi)始只提供水，柑橘大實(shí)蠅雌、雄性成蟲(chóng)的壽命均顯著長(zhǎng)于供蜜、供水供蜜和無(wú)水無(wú)蜜處理，雌、雄性成蟲(chóng)供蜜處理的壽命與無(wú)水無(wú)蜜處理間的差異不顯著；但是，從10日齡開(kāi)始，雌、雄性成蟲(chóng)供蜜與供水處理的壽命差異不明顯(黃聰,2015)。

1.3.2對(duì)成蟲(chóng)存活的影響研究發(fā)現(xiàn)，充足的水源對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)的存活最為有利，最長(zhǎng)可存活20 d，50%以上的個(gè)體可存活10 d以上；而缺乏水源或蜜源對(duì)成蟲(chóng)的存活不利。2~3日齡雌性成蟲(chóng)對(duì)水的選擇性較強(qiáng)，而4~7日齡雌性成蟲(chóng)對(duì)蜂蜜和水的選擇性沒(méi)有明顯差異。水源對(duì)于10日齡以上雌性成蟲(chóng)的存活十分重要(黃聰,2015)。

1.3.3對(duì)成蟲(chóng)梳理行為的影響既不提供食源也不提供水源或僅提供蜜源的雌性成蟲(chóng)，僅在前4 d具有梳理行為，供水供蜜的成蟲(chóng)梳理行為可持續(xù)6 d;而在羽化初期便開(kāi)始提供水源的成蟲(chóng)在第11天仍具有梳理行為(黃聰,2015)。

1.3.4對(duì)成蟲(chóng)爬行行為的影響從羽化當(dāng)日開(kāi)始既不提供水也不提供蜂蜜的雌、雄性成蟲(chóng)，前5 d趨上爬行的比例最高，為72.4%；提供水源或蜜源的雌、雄性成蟲(chóng)趨上爬行的比例均顯著降低；而同時(shí)提供水源和蜜源的成蟲(chóng)，趨上爬行的能力最低，表明當(dāng)食源充足時(shí)，成蟲(chóng)覓食活動(dòng)減少(黃聰,2015)。

1.4　水淹對(duì)柑橘大實(shí)蠅幼蟲(chóng)和蛹的影響

將脫果后的柑橘大實(shí)蠅老熟(3齡)幼蟲(chóng)水淹1~5 d后，觀察幼蟲(chóng)的存活及化蛹比率。結(jié)果顯示，盡管水淹后幼蟲(chóng)的昏迷率達(dá)33.6%~100%，但其恢復(fù)比率高達(dá)97%以上；幼蟲(chóng)死亡率僅為9.6%~26.8%；化蛹比率高達(dá)70.0%~90.4%。此外，蛹期或羽化期浸水對(duì)成蟲(chóng)羽化率沒(méi)有明顯的不利影響。由此可見(jiàn)，柑橘大實(shí)蠅幼蟲(chóng)和蛹抗水淹的能力很強(qiáng)，可隨落果借水流傳播擴(kuò)散(待發(fā)表數(shù)據(jù))。

2　越冬蛹保存介質(zhì)及貯存方法的研究

2.1　介質(zhì)組成和含水量對(duì)成蟲(chóng)羽化和性比的影響

以不同含水量及不同細(xì)沙和土壤組合作為保存介質(zhì)，逐日觀察成蟲(chóng)羽化情況。結(jié)果表明，當(dāng)土壤質(zhì)地為沙質(zhì)、含水量為10%和15%時(shí)，雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)羽化率以及總羽化率均較高；當(dāng)土壤質(zhì)地為菜園土?xí)r，雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)羽化率以及總羽化率隨含水量的升高而增大，即20%含水量時(shí)羽化率最高，而當(dāng)土壤含水量為5%時(shí)，無(wú)論是雌蟲(chóng)還是雄蟲(chóng)均不能羽化；將沙土和壤土以1∶1混合，當(dāng)含水量為10%和15%時(shí)，雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)羽化率以及總羽化率較高。此外，土壤質(zhì)地不同，柑橘大實(shí)蠅的雄性比例亦有所差異。當(dāng)含水量為10%時(shí)，沙質(zhì)土羽化的雄性成蟲(chóng)較菜園土多；但當(dāng)沙土和壤土混合以后，雄性成蟲(chóng)羽化的比例提高，且較沙質(zhì)土高。當(dāng)含水量為15%時(shí)，菜園土羽化的雄性成蟲(chóng)比例最高，其次為混合沙壤土。當(dāng)含水量為20%時(shí)，混合沙壤土羽化的雄性比例最高，其次為菜園土和沙質(zhì)土。同時(shí)，含水量不同，柑橘大實(shí)蠅的雄性比例亦有所區(qū)別。當(dāng)介質(zhì)為沙質(zhì)土且含水量為10%時(shí)，羽化的柑橘大實(shí)蠅雄性比例最高，為58.0%；當(dāng)介質(zhì)為菜園土且含水量為15%時(shí)，羽化的柑橘大實(shí)蠅雄性比例最高，為70.6%；當(dāng)介質(zhì)為等量混合沙壤土且含水量為20%時(shí)，羽化的柑橘大實(shí)蠅雄性比例最高，為74.7%。綜上所述，含水量為20%的細(xì)沙和土壤混合(1∶1)介質(zhì)對(duì)柑橘大實(shí)蠅的保存最為有利，成蟲(chóng)羽化率為 63.3%(黃聰,2015)。

2.2　越冬蛹貯存方法

黃聰(2015)研究了剝蛆法、蛆果堆放法以及傳統(tǒng)的化蛹池法對(duì)蛹體大小、羽化率以及成蟲(chóng)體重、性比、壽命等的影響。結(jié)果表明，由于剝蛆法利于越冬蛹的保存，易于控制溫度和羽化進(jìn)度，有利于獲得大批量的蛹和成蟲(chóng)。其中，化蛹池法羽化率最高，為62.2%；其次為剝蛆保存法，最終羽化率為54.6%；而蛆果堆放法羽化率最低，僅為17.4%。但是，化蛹池法雌蟲(chóng)體重最大，為 45.46 mg；而剝蛆保存法雄蟲(chóng)體重最輕，僅為34.69 mg。

2.3　幼蟲(chóng)密度對(duì)化蛹的影響

將老熟幼蟲(chóng)置于含水量為15%的細(xì)沙上，密度梯度分別為0.9、1.8、3.5、7.1和14.2頭·cm-2，觀察其化蛹情況。結(jié)果顯示，幼蟲(chóng)密度過(guò)低或過(guò)高，均會(huì)顯著降低其化蛹率及化蛹進(jìn)度。當(dāng)幼蟲(chóng)密度為1.8~3.5頭·cm-2時(shí)，化蛹率最高，達(dá)97.4%~98.4%；其次為0.9頭·cm-2，化蛹率為89.4%；當(dāng)幼蟲(chóng)密度為7.1~14.2頭·cm-2時(shí)，化蛹率明顯降低，僅為61.4%~78.8%。此外，當(dāng)幼蟲(chóng)密度較低(0.9~3.5頭·cm-2)時(shí)，有利于其整齊化蛹，4 d內(nèi)即可全部化蛹；而當(dāng)蟲(chóng)口密度較高時(shí)，化蛹進(jìn)程緩慢，整體化蛹時(shí)間延長(zhǎng)，達(dá)33 d(黃聰,2015)。

3　柑橘大實(shí)蠅人工飼養(yǎng)技術(shù)的研究

3.1　不同食物組合對(duì)成蟲(chóng)生殖特性的影響

王小姣等(2012)測(cè)定了蜂蜜水、糖醋液、蔗糖加酵母膏以及蔗糖加蛋白胨等4種飼料對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)存活、交配及產(chǎn)卵的影響。結(jié)果顯示，4種飼料喂食的成蟲(chóng)壽命和交配次數(shù)沒(méi)有明顯差異，而蔗糖加蛋白胨喂食的成蟲(chóng)單雌產(chǎn)卵量最高，約為20粒，顯著高于其他3種飼料，且這3種飼料喂食后的單雌產(chǎn)卵量之間沒(méi)有顯著差異。成蟲(chóng)壽命最長(zhǎng)為20 d，期間交配3~4次。針對(duì)室內(nèi)飼養(yǎng)成蟲(chóng)壽命比較短的問(wèn)題，在上述研究的基礎(chǔ)上，改良了成蟲(chóng)飼養(yǎng)配方，分別以蛋白胨+金銀花蜜、酸水解蛋白+金銀花蜜、大豆粉+金銀花蜜為配方，以無(wú)蛋白的純金銀花蜜水為對(duì)照，研究了不同蛋白干粉飼料配方對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)存活、交配的影響。結(jié)果顯示，3種蛋白干粉飼料均可滿(mǎn)足成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的需要，70%~90%的個(gè)體至少存活25 d，少量個(gè)體可存活70 d以上。此外，研究還顯示，蛋白干粉對(duì)成蟲(chóng)壽命及交配次數(shù)無(wú)不良影響(王小姣等,2012)。

3.2　不同食物組合對(duì)幼蟲(chóng)發(fā)育的影響

測(cè)定了3種人工飼料配方(表1)對(duì)柑橘大實(shí)蠅幼蟲(chóng)存活和發(fā)育進(jìn)度及化蛹比率的影響。結(jié)果顯示，以3種配方飼養(yǎng)初齡幼蟲(chóng)至第4天時(shí)，幼蟲(chóng)的存活率分別為63.1%、51.9%和49.1%；研究還顯示，以配方B飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)存活時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)36 d；以配方C飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)化蛹比率最高，為9.5%。可見(jiàn)，3種人工飼料基本可以滿(mǎn)足柑橘大實(shí)蠅生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需求(待發(fā)表數(shù)據(jù))。

表1　柑橘大實(shí)蠅幼蟲(chóng)人工飼料配方

4　柑橘大實(shí)蠅蛹滯育機(jī)制研究

針對(duì)柑橘大實(shí)蠅每年發(fā)生1代，滯育明顯，難以規(guī)?；曫B(yǎng)的問(wèn)題，在cDNA測(cè)序及部分結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，克隆獲得滯育激素(Diapause hormone,DH)基因和促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)基因的部分序列；據(jù)此，采用5′RACE和3′RACE技術(shù)克隆其全長(zhǎng)cDNA，并利用定量PCR檢測(cè)這2個(gè)基因在柑橘大實(shí)蠅不同滯育階段的mRNA表達(dá)狀況，從而揭示DH和PTTH基因在柑橘大實(shí)蠅蛹滯育中的作用。

4.1　內(nèi)參基因的選擇

選取α-TUB、β-TUB、β-actin、EF1-α、ELF1-β、G6PDH、RPL32、18s rRNA、28s rRNA、GAPDH等10種內(nèi)參基因，利用引物克隆其中間片段，并通過(guò)半定量PCR檢測(cè)這10種內(nèi)參基因在柑橘大實(shí)蠅不同時(shí)期(卵,幼蟲(chóng),以及1、90、160日齡蛹，雌性成蟲(chóng)，雄性成蟲(chóng))的表達(dá)狀況。結(jié)果表明，在柑橘大實(shí)蠅的不同時(shí)期，內(nèi)參基因α-TUB、RPL32、EF1-α、28s rRNA與18s rRNA表達(dá)相對(duì)比較穩(wěn)定，而β-actin和GAPDH等則不能穩(wěn)定表達(dá)；不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，α-TUB、EF1-α和 RPL32 在各個(gè)時(shí)期均能穩(wěn)定表達(dá)(Lüetal.,2014a)。

4.2滯育相關(guān)熱激蛋白基因hsp23、hsp70和hsp90的克隆及表達(dá)

通過(guò)同源序列比對(duì)算法，以及3′RACE和5′RACE技術(shù)克隆，獲得柑橘大實(shí)蠅hsp23、hsp70和hsp90基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其在不同發(fā)育階段的表達(dá)譜進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，hsp23、hsp70和hsp90基因的cDNA序列分別為810、2295和1755 bp，其各自具有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，3′端具有polyA結(jié)構(gòu)。從卵、幼蟲(chóng)、蛹至成蟲(chóng)羽化的整個(gè)時(shí)期，3種熱激蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)各異。其中，hsp90的相對(duì)表達(dá)量始終處于較低水平(<2)，僅在1和3齡幼蟲(chóng)期、30日齡蛹期以及成蟲(chóng)期有較小的表達(dá)高峰；hsp70在3齡幼蟲(chóng)期具有一個(gè)高的表達(dá)峰值(≈8)，在卵期和30日齡蛹期分別具有一個(gè)較小的表達(dá)高峰(<2)；而hsp23的相對(duì)表達(dá)量較高，整個(gè)時(shí)期具有4個(gè)明顯的高峰，且在30日齡蛹期前后(7~90日齡)和150日齡蛹期前后(140~160日齡)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。此外，在卵期，3種熱激蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量相差無(wú)幾；在1齡幼蟲(chóng)期，hsp90的相對(duì)表達(dá)量最高；在2齡幼蟲(chóng)期，3種熱激蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量最低；在3齡幼蟲(chóng)期，hsp70的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為hsp23，hsp90的相對(duì)表達(dá)量最低；而在整個(gè)蛹期，hsp23的相對(duì)表達(dá)量明顯較hsp70和hsp90高。這表明hsp70在柑橘大實(shí)蠅滯育信號(hào)接收期(即3齡幼蟲(chóng)期)具有重要調(diào)控作用；而hsp23在柑橘大實(shí)蠅整個(gè)滯育期(即蛹期)具有重要調(diào)控作用(Lüetal.,2014b)。

4.3　柑橘大實(shí)蠅RNAi體系的構(gòu)建

以穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因18s rRNA為靶標(biāo)，利用含T7啟動(dòng)子的內(nèi)參基因18s rRNA引物合成其雙鏈RNA。然后，將1 μL不同濃度(2和3 μg·μL-1)的dsRNA通過(guò)顯微注射(130 Pa，0.5 s)注入柑橘大實(shí)蠅3齡幼蟲(chóng)體內(nèi),分別取注射當(dāng)天(0 d)以及1、2、3和5 d的幼蟲(chóng)各5頭，以α-TUB作為對(duì)照，通過(guò)定量PCR檢測(cè)干擾后18s rRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，當(dāng)注射的dsRNA濃度為2 μg·μL-1時(shí)，1 d后幼蟲(chóng)體內(nèi)18s rRNA的表達(dá)量下降了64.8%；雖然在注射后第2天和第3天的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，但5 d后又有所下降，說(shuō)明dsRNA的效果一直在持續(xù)。當(dāng)注射濃度為3 μg·μL-1時(shí)，幼蟲(chóng)體內(nèi)18s rRNA的表達(dá)量在第1 天和第2天稍有上升，在3 d后下降明顯；5 d后雖有所上升，但其表達(dá)量與對(duì)照相當(dāng)。這表明注射過(guò)高濃度的dsRNA，不能起到抑制表達(dá)的作用，而隨著幼蟲(chóng)體內(nèi)dsRNA濃度的逐漸降低，才具有沉默效果。據(jù)此，構(gòu)建柑橘大實(shí)蠅RNAi體系時(shí)，以濃度為2 μg·μL-1、注射量為1 μL作為靶基因的注射標(biāo)準(zhǔn)(待發(fā)表數(shù)據(jù))。

柑橘大實(shí)蠅滯育相關(guān)基因的研究，為解除滯育、實(shí)現(xiàn)室內(nèi)大量飼養(yǎng)提供了理論依據(jù)，為開(kāi)展其輻照不育技術(shù)和遺傳不育控制技術(shù)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，并有望使柑橘大實(shí)蠅不育技術(shù)得以大面積推廣應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)治理。

5　柑橘大實(shí)蠅輻照不育技術(shù)的研究與應(yīng)用

5.1　適宜輻照劑量

以4級(jí)蛹作為輻照對(duì)象，以60Co-γ射線進(jìn)行適宜輻照劑量研究。結(jié)果顯示，70~110 Gy 的輻照劑量對(duì)成蟲(chóng)羽化和羽化節(jié)律沒(méi)有明顯不利影響，其中 80 Gy 輻照后，其羽化率略有升高。進(jìn)一步研究顯示，輻照劑量對(duì)柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)的雌性比率具有明顯影響，但當(dāng)輻照劑量為80 Gy時(shí)，其雌性比率與對(duì)照最為接近。同時(shí)，60Co-γ射線輻照能縮短柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)壽命，由未被輻照(對(duì)照)時(shí)的33.5(雌性)和35.3 d(雄性)縮短為15.8~21.5 d；但當(dāng)輻照劑量為70 Gy時(shí)，其雌、雄成蟲(chóng)壽命與對(duì)照沒(méi)有明顯差異。此外，當(dāng)輻照劑量為70 Gy時(shí)，雌、雄性成蟲(chóng)飛行距離和飛行速率均未受到明顯影響，分別為17.1、16.7 km·h-1和3.9、3.8 km·h-1(黃聰?shù)?2015)。

5.2　適宜輻照時(shí)期

以90 Gy為輻照劑量，分別對(duì)1~4級(jí)蛹進(jìn)行輻照，結(jié)果顯示，除1級(jí)外，其他3個(gè)級(jí)別的蛹通過(guò)60Co-γ射線輻照后，成蟲(chóng)羽化率均提高，其中2級(jí)蛹最為明顯，可能與輻照具有一定程度的殺菌作用有關(guān)。此外，蛹的發(fā)育時(shí)期不同，輻照后其所羽化的成蟲(chóng)個(gè)體中雌蠅所占的比率亦有明顯變化，其中3級(jí)蛹的雌性比率與對(duì)照最為接近。綜合羽化率和雌性比率，在3級(jí)蛹時(shí)輻射比較恰當(dāng)，且對(duì)田間應(yīng)用較為有利(黃聰?shù)?2015)。

5.3　輻照對(duì)柑橘大實(shí)蠅交配競(jìng)爭(zhēng)力的影響

以不同時(shí)期的柑橘大實(shí)蠅蛹為輻照對(duì)象，其成蟲(chóng)交配次數(shù)沒(méi)有明顯變化，但3級(jí)雌蠅的交配持續(xù)時(shí)間較對(duì)照明顯縮短。同時(shí)，無(wú)論競(jìng)爭(zhēng)者是雄性還是雌性，輻照蟲(chóng)與未輻照蟲(chóng)的交配競(jìng)爭(zhēng)力均相當(dāng)(黃聰?shù)?2014a)。

5.4　輻照對(duì)柑橘大實(shí)蠅活動(dòng)能力的影響

以60Co-γ射線90 Gy為輻照劑量，以2~3級(jí)蛹為輻照對(duì)象，觀察同日羽化的輻照和未輻照成蟲(chóng)的活動(dòng)能力。結(jié)果顯示，輻照后5日齡內(nèi)的雌性成蟲(chóng)的爬行能力明顯增強(qiáng)，但12日齡時(shí)雄性成蟲(chóng)的爬行能力降低；而雌性成蟲(chóng)的梳理行為減少45%~80%；但直至12日齡，輻照對(duì)成蟲(chóng)的趨上爬行能力均沒(méi)有明顯不良影響(談施緣等,2013)。

5.5　輻照對(duì)柑橘大實(shí)蠅引誘劑敏感性的影響

以橘園常用的引誘劑桔豐和果瑞特為靶標(biāo)，研究輻照對(duì)柑橘大實(shí)蠅引誘劑敏感性的影響。結(jié)果表明，輻照后柑橘大實(shí)蠅雌、雄蟲(chóng)對(duì)2種引誘劑的敏感性明顯降低，僅為田間自然種群的8.7%~15.4%。這表明誘殺技術(shù)和輻照技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用具有增效作用，對(duì)輻照技術(shù)的應(yīng)用意義重大(黃聰?shù)?2014b)。

5.6　輻照不育技術(shù)的防控效果

以湖北省宜都市枝城鎮(zhèn)和松枝市旗林鎮(zhèn)相對(duì)封閉的橘園為防治試驗(yàn)田，開(kāi)展了輻照不育技術(shù)防治柑橘大實(shí)蠅的研究(輻照蟲(chóng)與蟲(chóng)口基數(shù)比例約為0.9∶1.0)，并對(duì)輻照成蟲(chóng)進(jìn)行了標(biāo)記與回收。結(jié)果顯示，輻照不育成蟲(chóng)的田間擴(kuò)散距離多在70 m以?xún)?nèi)，最遠(yuǎn)擴(kuò)散距離可達(dá)140 m。進(jìn)一步調(diào)查顯示，輻照不育技術(shù)與食餌誘殺技術(shù)對(duì)柑橘大實(shí)蠅的控制作用相當(dāng)，有產(chǎn)卵痕橘果的比率僅為0.45%。此外，輻照不育技術(shù)和食餌誘殺技術(shù)對(duì)雌性成蟲(chóng)產(chǎn)卵不利，使有產(chǎn)卵痕橘果中卵的數(shù)量降低2~3倍，無(wú)效產(chǎn)卵的比率明顯增大。同時(shí)，防治方法對(duì)成蟲(chóng)產(chǎn)卵行為有一定影響。在輻照不育技術(shù)防治的橘園中，有1個(gè)產(chǎn)卵痕的橘果占所有具產(chǎn)卵痕橘果的97%以上，有2個(gè)產(chǎn)卵痕的橘果不足3%；在食餌誘殺防治田，有2、3個(gè)產(chǎn)卵痕的橘果占所有具產(chǎn)卵痕橘果的8%；而在未采取任何防治措施的對(duì)照橘園中，有2、3個(gè)產(chǎn)卵痕的橘果比率明顯增大，分別占所有具產(chǎn)卵痕橘果的33%、15%。在不同防治方法的橘園中，產(chǎn)卵痕數(shù)量的不同可能與田間柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)發(fā)生數(shù)量不同有關(guān)；而無(wú)效產(chǎn)卵比率的增大，可能與輻照不育防治田和食餌誘殺防治田雌性有效交配機(jī)率下降有關(guān)。此外，輻照不育技術(shù)(加誘殺技術(shù))防治橘園的蟲(chóng)口密度為0.081頭·果-1，蛆果率為2.08%；而僅采用誘殺技術(shù)的橘園中蟲(chóng)口密度為0.457頭·果-1，蛆果率為6.33%，防治效果為67.14%(黃聰?shù)?2013)。

針對(duì)柑橘大實(shí)蠅食性單一(只危害蕓香科植物)，每年發(fā)生1代且蛀果為害，成蟲(chóng)田間壽命長(zhǎng)且行蹤不定，難以有效防控的問(wèn)題，應(yīng)采用行為學(xué)、種群生態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)以及分子生物學(xué)的技術(shù)與方法，開(kāi)展柑橘大實(shí)蠅靶向防控技術(shù)研究，具體尚需研究的主要內(nèi)容包括：成蟲(chóng)橘園外的行為，成蟲(chóng)取食與卵黃蛋白形成機(jī)制，化蛹特性及蛹期天敵，滯育解除的關(guān)鍵技術(shù)，規(guī)模化飼養(yǎng)技術(shù)，以及遺傳不育技術(shù)，明確柑橘大實(shí)蠅基礎(chǔ)生物學(xué)特性及其成災(zāi)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)柑橘大實(shí)蠅的可持續(xù)治理。

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Jian-ying GUO1,2, Chuan-ren LI3, Fang-hao WAN1,2，4*

1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural

Sciences,Beijing100193,China;2Center for Management of Invasive Alien Species, Ministry of Agriculture, Beijing 100193,

China;3College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China;4College of Agronomy

andPlantProtection,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong266109,China

Abstract:Bactrocera minax (Enderlein), the Chinese citrus fruit fly, is one of the most important citrus pests in southern China. In recent years, the damage caused by this species on citrus plants has increased, causing the citrus industry suffer a great loss. In this paper, knowledge on the effects of environmental factors, including temperature, photoperiod, as well as adult nutrition (hunger, thirst) and tolerance to flooding in mature larvae, and on adult behavior of B. minax are evaluated. The parameters of artificial diet for mass rearing of B. minax adults and larvae, as well as the diapausing mechanisms of B. minax pupa is now clarified. The key techniques for IST (irradiation sterile technique), including the optimal irradiation dose of the60Co-γ ray and the optimal development status of irradiated B. minax pupa were clarified, leading to the first successful attempt to use IST to control B. minax in an orange orchard in Hubei Province. Finally, a proposal for further research on the sustainable management of B. minax is proposed.

Key words:Bactrocera minax; sterile insect technique; artificial diet; diapausing mechanism

DOI:10. 3969/j.issn.2095-1787.2015.02.010