王雪銘，許程劍，牛博楠，盧士玲

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

胃-胰蛋白酶聯(lián)合酶解阿魏菇蛋白制備抗氧化多肽

王雪銘，許程劍*，牛博楠，盧士玲

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

為了建立酶解阿魏菇蛋白制備抗氧化多肽的最佳優(yōu)化條件，采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分步水解的方法。運用四因素三水平的正交試驗確定胃蛋白酶的酶解優(yōu)化組合，以水解度和DPPH自由基清除能力為響應(yīng)值，最終確定酶解的最優(yōu)組合為：酶解時間1 h，酶添加量8 000U/g，底物濃度1%，pH2。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法研究胰蛋白酶酶解時間、酶添加量、pH、底物濃度對工藝的影響，以羥自由基（·OH）為響應(yīng)值，確定的酶解最優(yōu)條件為：酶解時間1.42 h，酶添加量7 744.93U/g，pH7.96，底物濃度1.35%，此條件下的·OH清除率為74.7%，與理論值75.59%相對誤差在1%以內(nèi)，說明所建立的模型具有較好的擬合性。

阿魏菇蛋白；抗氧化多肽；響應(yīng)面分析法；最優(yōu)條件

阿魏菇（Pleurotus ferulae）是新疆特有的菌類，其因寄生或腐生在中藥阿魏肥大的根莖部而得名。在我國阿魏菇僅分布于新疆荒漠地區(qū)的木壘、托里、阿勒泰、伊梨、塔城等地，與其寄主阿魏的分布是一致的[1]。阿魏菇集食用、藥用、美容于一身，營養(yǎng)豐富全面并且各類營養(yǎng)物質(zhì)含量都很高[2-3]，被譽為當(dāng)今食用菌“皇后”。阿魏菇菇體潔白高大，肉質(zhì)細(xì)膩鮮嫩，味美可口，營養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量占干菇的20%，含有18種氨基酸，人體8種必需氨基酸全部具備。阿魏菇還在抗腫瘤，抗疲勞，抗誘變，免疫調(diào)節(jié)[3-5]等各方面都有良好的開發(fā)利用前景。

在新疆阿魏菇資源一直沒有得到充分的應(yīng)用和重視，其一是阿魏菇的價值沒有受到重視；其二應(yīng)該對阿魏菇中的活性成分從分離純化、理化性質(zhì)和生物學(xué)活性等方面沒有進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。從現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道了解到，各國學(xué)者選用的菌類、產(chǎn)地不一致，因此所分離鑒定的活性物質(zhì)也不同。近年來，對于阿魏菇的研究主要集中在多糖方面，目前沒有研究阿魏菇多肽的相關(guān)報道，因此提取阿魏菇中的蛋白質(zhì)并對其進(jìn)行酶解制備具有抗氧化活性的多肽，為阿魏菇的深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏菇：新疆清河產(chǎn)；胃蛋白酶：Biotopped；胰蛋白酶：Sigma；甲醛為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV759紫外可見分光光度器：上海精科；BS2000電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；LG100B鼓風(fēng)干燥箱：上海實驗儀器廠；Neofuge15R臺式高速冷凍離心機：香港力康；真空冷凍干燥：上海愛朗儀器有限公司；酸度計：德國賽多利斯股份公司。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化肽制備流程

阿魏菇蛋白→胃蛋白酶酶解→冷凍干燥→蛋白酶酶解→冷凍干燥

1.3.2 胃蛋白酶酶解條件的確定

胃蛋白酶水解后，以水解度和DPPH自由基清除能力為評價指標(biāo)，分別研究了酶解時間（1、2、3、4 h），酶添加量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g），底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%），pH（1、1.5、2、2.5、3）4個因素，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交試驗，正交試驗設(shè)計表如表1所示。最終確定胃蛋白酶酶解的最優(yōu)組合。每個實驗均重復(fù)3次，取平均值。

表1 正交試驗因素表Tab le1 Design of factors and levels of orthogonal experiment

1.3.3 胰蛋白酶酶解條件的確定

阿魏菇蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解后，用胰蛋白酶繼續(xù)酶解，酶解后以水解度和·OH清除能力為評價指標(biāo)，考察酶解時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h），酶添加量（4 000、6 000、80 00、10 000、12 000、14 000 U/g），pH（7.5、7.8、8.0、8.2、8.5），底物濃度（0.5%、1%、2%、3%、4%）4個因素，并進(jìn)行了四因素三水平的響應(yīng)面分析，響應(yīng)面設(shè)計表如表2所示，最終確定胰蛋白酶酶解的最優(yōu)條件。

表2 響應(yīng)面實驗因素表Table2 Design of factors and levels of esponse surface experiment

1.3.4 蛋白酶活力的測定

工業(yè)用酶通用方法，參照QB/T 1803-1993。

水解度的測定：運用甲醛滴定法，參照GB/T5009. 39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》。

DPPH自由基清除能力的測定：參照Qiang Zhao等[6]的方法。

·OH自由基清除能力的測定：參照林倩[7]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶酶解效果

2.1.1 胃蛋白酶酶解時間對阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影響

以蛋白水解度和DPPH清除能力為指標(biāo)，選擇1、2、3、4 h 4個點考察胃蛋白酶酶解時間的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 胃蛋白酶酶解時間對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.1 Theeffect of pepsin hydrolysis time on DH and DPPH radical scavenging capacity

由圖1可知，水解度和DPPH清除能力均先隨酶解時間的增加而升高，在3 h時都達(dá)到最大值，繼續(xù)增加酶解時間，水解度增高緩慢，DPPH清除能力下降明顯，選取最優(yōu)酶解時間為3 h。

2.1.2 胃蛋白酶酶添加量對阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影響

考察了胃蛋白酶酶添加量2000、4000、6000、8 000、10 000U/g 5個點對水解度和DPPH清除能力的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 胃蛋白酶酶添加量對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.2 The effect of pepsin dosage on DH and DPPH radical scavenging capacity

由圖2可知，水解度隨著酶添加量的增加呈上升趨勢，在8000U/g時達(dá)到最大，繼續(xù)增大都水解度降低，DPPH清除能力隨酶添加量呈先增大后降低的趨勢，在6 000U/g時達(dá)到最大，但6 000U/g與8 000U/g兩點的DPPH清除能力相差不大，綜合考慮，選擇酶添加量8 000U/g為最優(yōu)。

2.1.3 底物濃度對阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影響

將底物濃度設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%，分別考察蛋白水解度和水解液的DPPH自由基清除能力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物濃度對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 The effect of concentration of substrate on DH and DPPH radical scavenging capacity

由圖3可以看出，水解度隨底物濃度的增加呈顯著降低的趨勢，而DPPH清除能力隨底物濃度增加而增大，并且水解度由底物濃度1%～2%增加的過程降低顯著，因此選擇1%為最佳底物濃度。

2.1.4 pH對阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影響

根據(jù)胃蛋白酶標(biāo)簽最佳pH為1～3，故分別考察了pH 1、1.5、2、2.5、3五個梯度對蛋白水解度和DPPH清除能力，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，水解度隨著pH的增加而增大，在pH 2時達(dá)到了最大活性，能夠水解最多的阿魏菇蛋白。并且DPPH也隨的pH增加而增大，在pH為2.5時達(dá)到最大，與pH 2時相差不大，綜合考慮，選擇2為胃蛋白酶最適pH。

圖4 pH對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 The effect of pH on DH and DPPH radical scavenging capacity

2.1.5 胃蛋白酶正交試驗結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上，選取酶解時間、酶添加量、底物濃度、pH 4個因素，按照L9（34）設(shè)計正交試驗，結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗方案及結(jié)果分析L9（34）Tab le3 The scheme and results of orthogonal test analysis L9（34）

由表3可以看出，影響胃蛋白酶酶解阿魏菇蛋白水解度的因素的主次順序為pH＞酶解時間＞底物濃度＞酶添加量，對于水解度，綜合考慮各因素的K值和直觀分析，酶解的最佳組合為酶解時間為1 h，酶添加量為8 000U/g，底物濃度0.5%，pH2。影響胃蛋白酶酶解阿魏菇蛋白DPPH清除能力的因素的主次順序：底物濃度＞pH＞酶解時間＞酶添加量，通過直觀分析，最佳組合：酶解時間2 h，酶添加量1000U/g，底物濃度1%，pH1.5。綜合水解度和DPPH清除能力的影響效果，并以對水解度影響的效果為主，DPPH清除能力的效果為輔，最終確定的胃蛋白酶水解最優(yōu)組合：酶解時間1 h，酶添加量8 000U/g，底物濃度1%，pH2。按此最佳工藝組合重復(fù)三次實驗，胃蛋白酶水解阿魏菇蛋白的水解度為16.3%，DPPH清除能力為57.4%。最佳工藝較好的表明了該方案可行。

2.2 胰蛋白酶酶解效果

2.2.1 酶解時間的影響

酶解時間的影響如圖5所示。

圖5 胰蛋白酶酶解時間對水解度和·OH自由基清除能力的影響Fig.5 The effect of trypsin hydrolysis time on DH and·OH radical scavenging capacity

由圖5可知，隨著酶解時間的延長水解度先增加后趨于穩(wěn)定，說明蛋白暴露的酶切位點充分被切開[8]。但隨著時間的延長，·OH清除能力呈先增加后降低的趨勢，可能是由于隨著時間的增加將具有抗氧化的多肽進(jìn)一步切斷，使其失去抗氧化性，為了保證最優(yōu)的抗氧化活性，選取酶解時間為1.5 h。

2.2.2 酶添加量的影響

酶添加量的影響如圖6。

圖6 胰蛋白酶酶添加量對水解度和·OH自由基清除能力的影響Fig.6 The effect of trypsin dosage on DH and·OH radical scavenging capacity

如圖6所示，隨著酶添加量的增大，蛋白水解度先增大后達(dá)到飽和，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，不斷增大酶量會造成酶的浪費，增加成本。并且隨著時間的延長·OH清除能力先增大后降低，可能是隨著酶添加量的增大，使蛋白水解成小分子的多肽或氨基酸[9]，使具有抗氧化性的多肽量減少，抗氧化活性降低，因此選取酶添加量為8 000U/g為最優(yōu)。

2.2.3 pH的影響

pH的影響如圖7所示。

根據(jù)酶標(biāo)簽所示的pH適宜范圍7.5～8.5，水解度和·OH清除能力都是隨pH增大先升高后降低，因為每一種酶酶解物質(zhì)時都有其最適的pH，在最適的pH時具有最高的活性[10]，根據(jù)變化趨勢，pH8為胰蛋白酶的最適pH。

圖7 pH對水解度和·OH自由基清除能力的影響Fig.7 The effect of pH on DH and·OH radical scavenging capacity

2.2.4 底物濃度的影響

底物濃度的影響如圖8所示。

圖8 底物濃度對水解度和·OH自由基清除能力的影響Fig.8 The effect of concentration of substrate on DH and·OH radical scavenging capacity

隨著底物濃度的增加，水解度隨之降低，可能是由于底物濃度越大，與酶的有效結(jié)合力越低，酶解的越不充分。·OH清除能力隨底物濃度的增加先增大后降低，綜合考慮選取底物濃度為1%為最優(yōu)。

2.2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取酶解時間、酶添加量、pH、底物濃度4個因素，分別篩選3個水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，以阿魏菇多肽清除·OH能力為響應(yīng)值，探究胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白的最佳工藝參數(shù)。實驗結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table4 The design and results of response surface experiment

續(xù)表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table4 The design and results of response surface experiment

表5 回歸方程顯著性檢驗Table5 Significance check of the regression equation

通過Design Expert8.05軟件分析，得出二次回歸方程為：·OH清除能力 =74.16-5.93*A-1.95*B-3.41*C+7.01*D-0.7*A*B+0.56*A*C+1.11*A*D-1.81*B*C-0.36*B*D-5.02*C*D-18.83*A2-5.85*B2-8.85*C2-29.75*D2。

由表5的顯著性方差分析[11]可知，模型的P＜0.000 1極顯著，失擬項P=0.508 7＞0.05不顯著。表明建立的該模型可以用來分析和預(yù)測胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白的工藝參數(shù)?；貧w方程的顯著性分析表明，A、C、D、CD、A2、B2、C2、D2項顯著，且回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2= 0.965 2，也是極顯著的，因此可用回歸方程代替試驗真實點對結(jié)果進(jìn)行分析。

根據(jù)回歸方程繪制的響應(yīng)面圖，可以有效預(yù)測并檢驗變量的響應(yīng)值同時確定各個變量之間的相互作用關(guān)系。分析底物濃度、pH的交互作用對·OH清除能力的影響，同時預(yù)測較優(yōu)值。根據(jù)回歸方程做出模型的響應(yīng)曲面及其等高線見圖9。

圖9 pH與底物濃度交互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.9 Curved surface chartof pH and concentration of substrate

由圖9可看出，底物濃度和pH之間的交互作用顯著，底物濃度固定不變，·OH清除能力隨著pH的增大先升高后降低，變化不顯著。固定pH，隨著底物濃度的增大，·OH清除能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且變化較顯著。由等高線圖可以直觀的看出，在一定區(qū)域內(nèi)存在較優(yōu)值，在底物濃度1.5%，pH2左右，阿魏菇多肽的·OH清除能力達(dá)到最大值。

采用Design Expert8.05軟件對實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白制備抗氧化多肽的最優(yōu)參數(shù)為酶解時間1.42 h，酶添加量7 744.93 U/g，pH 7.96，底物濃度1.35%，在此條件下·OH清除能力的理論值達(dá)到75.59%。在此條件下，實驗重復(fù)三次，最終得到的·OH清除能力的平均值為74.7%，與理論值基本一致。結(jié)果表明，該模型可以較好地反映出胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白的條件，從而也證明了響應(yīng)曲面法優(yōu)化胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白條件參數(shù)的可行性。

3 結(jié)論

結(jié)合人體的消化系統(tǒng)，選取人體消化道內(nèi)具有的胃蛋白酶和胰蛋白酶分步水解阿魏菇蛋白制備抗氧化多肽，在單因素的基礎(chǔ)上確定了合適的因素水平，然后通過正交試驗和響應(yīng)面試驗對條件進(jìn)行優(yōu)化。最終確定的胃蛋白酶酶解條件為：酶解時間1 h，酶添加量8 000U/g，底物濃度1%，pH2，再加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的酶解參數(shù)為：酶解時間1.42 h，酶添加量7 744.93U/g，pH7.96，底物濃度1.35%，最終的·OH清除能力為74.7%。由此可知，合理食用阿魏菇可以有效的清除體內(nèi)的自由基，從而在一定程度上延緩衰老。

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Preparation of Antioxidant Peptides by Pepsin-trypsin Combined Enzymatic Hydrolysis from Pleurotus FerulaeLenzi

WANG Xue-ming，XU Cheng-jian*，NU Bo-nan，LU Shi-ling
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi832000，Xinjiang，China）

In order to establish the optimum conditions of preparation antioxidant peptides from Pleurotus Ferulae Lenzi protein，using pepsin and trypsin hydrolysis.The optimum technological conditions of pepsin hydrolysis were obtained by single factor and orthogonal array design methods，the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity for response.The optimum conditions for pepsin hydrolysis method were as follows：hydrolysis time 1 h，enzyme dosage 8 000 U/g，substrate concentration 1%，pH2.On this basis，utilizing response surface for analysis of tryptic hydrolysis time，enzyme dosage，pH，substrate concentration，hydroxyl radical（·OH）as a response to determine the optimal conditions for tryptic hydrolysis as follows：hydrolysis time 1.42 h，enzyme dosage 7 744.93U/g，pH7.96，substrate concentration 1.35%，in this condition the·OH clearance was 74.7%，the relative error with the theoretical value 75.59%was less than 1%，indicating that that the model has a good fit of the experiment.

Pleurotus Ferulae Lenzi protein；antioxidant peptides；response surface analysis；the optimal conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.006

2014-08-27

國家自然科學(xué)基金項目（31101256）；石河子大學(xué)高層次人才科研啟動項目（RCZX201021）

王雪銘（1990—），男（漢），在讀研究生，研究方向：天然產(chǎn)物制備與功能活性研究。

*通信作者：許程劍（1978—），男（漢），副教授，博士，主要從事天然活性物質(zhì)功能的研究。