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        高通量RNAi及其在細胞生物學(xué)特性研究中的應(yīng)用

        2015-12-17 21:59:00信吉閣曾養(yǎng)志
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:哺乳動物果蠅高通量

        信吉閣,曾養(yǎng)志

        (1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南省版納微型豬近交系重點實驗室,云南昆明 650201)

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        高通量RNAi及其在細胞生物學(xué)特性研究中的應(yīng)用

        信吉閣1,2,曾養(yǎng)志2

        (1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南省版納微型豬近交系重點實驗室,云南昆明 650201)

        高通量RNAi(high-throughput screens HTSs)技術(shù)是近年來基因功能研究的高效工具?,F(xiàn)已在多個物種的細胞內(nèi)進行了大量基因組范圍RNAi高通量篩選,用于研究多種不同的生物學(xué)過程,為生物醫(yī)學(xué)研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。就高通量RNAi技術(shù)原理、實驗操作及其在研究與細胞生物特性相關(guān)基因中的主要應(yīng)用進展進行了綜述。

        RNAi;高通量;細胞學(xué)

        RNA干擾(RNA interference,RNAi)是高通量分析基因功能的有效工具。近年來在果蠅和哺乳動物細胞內(nèi)進行了許多基因組RNAi高通量篩選(RNAi high-throughput screens ,HTSs),用于研究多種不同的生物學(xué)過程,包括信號傳導(dǎo)、癌生物學(xué)、宿主細胞對感染的反應(yīng)等。利用RNAi HTSs發(fā)現(xiàn)了許多生物過程中的結(jié)構(gòu)組分,并對復(fù)雜的生物系統(tǒng)提出了一些新的理論,進而形成具有創(chuàng)新性的研究細胞功能的方法。筆者對高通量RNAi技術(shù)原理、試驗操作及其在研究與細胞生物特性相關(guān)基因中的應(yīng)用進行了綜述。

        1 高通量RNAi篩選

        RNAi是RNA依賴的基因沉默現(xiàn)象,是雙鏈RNA (double stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA 水平上誘導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默,可對內(nèi)源或外源dsRNA發(fā)生反應(yīng),以序列特異的方式下調(diào)(降低但不消除)靶RNA[1-2]。2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予美國科學(xué)家Andrew Fire 和Craig Mello,以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNAi機制。近年來在此領(lǐng)域開展了多個方向的研究,如21~28 nt長度的小RNA的起源和功能研究,包括microRNAs(miRNAs)、內(nèi)源短干擾RNAs(endo-siRNAs)等,這些研究從嶄新的角度闡明了一些生物學(xué)觀點[3-5],同時RNAi誘導(dǎo)產(chǎn)物也已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)治療[6]。RNAi作為在mRNA水平進行特異敲除的分子工具,廣泛應(yīng)用于細胞、組織、器官的基因功能研究,如秀麗線蟲、果蠅、哺乳細胞、扁蟲、擬南介等[7-10]。

        RNAi技術(shù)與DNA和基因測序數(shù)據(jù)結(jié)合,有希望構(gòu)建RNAi反應(yīng)物全基因組文庫,廣泛應(yīng)用于多種細胞類型中[11]。HTSs技術(shù)可在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)地研究特定細胞表型對應(yīng)的內(nèi)在功能基因,進行系統(tǒng)功能分析,突破了先前只能在相對小的范圍內(nèi)選擇易操作的模型器官中進行的局限,同時可在多基因互作下分析藥物作用,得到用于臨床藥物治療效果評價的標(biāo)志基因或藥物治療的新靶點基因[12]。在此領(lǐng)域最重要的應(yīng)用是能夠在哺乳動物細胞中進行全基因組范圍RNAi HTSs。目前在哺乳動物細胞中進行RNAi篩選已經(jīng)得到了大量有重要生物醫(yī)學(xué)意義的結(jié)果,包括鑒定新的致癌基因、可能的靶位點,醫(yī)學(xué)治療等[13-15]。

        2 高通量RNAi篩選實驗方法

        在研究某一基因的功能時,可利用RNAi下調(diào)該基因表達,直接或間接檢測到基因表型和功能的改變。RNAi既可用于小范圍的基因研究也可用于高通量基因篩選。以細胞為基礎(chǔ)的RNAi HTSs,通常有2種可供選擇的篩選方式,一種是合并的形式,文庫以隨機的方式引入細胞,一種是排列的形式,在微量滴定板每個孔上分別轉(zhuǎn)染單個基因[16]。這2種方法都已成功地應(yīng)用到研究中。合并方法在標(biāo)準(zhǔn)實驗室設(shè)備下比陣列篩選更可行,陣列篩選需要自動化和特殊的陣列讀出儀器,但陣列篩選在檢測后,可通過數(shù)據(jù)庫或電子數(shù)據(jù)表簡單地查找在已知測定孔反應(yīng)物特征,很容易判定哪些細胞是由哪些特異RNAi反應(yīng)物處理的。

        特異的下調(diào)的RNAi反應(yīng)物在不同細胞類型、組織、不同測定法中也不同,在細胞基礎(chǔ)的HTSs采用的典型的四類型的RNAi反應(yīng)物是dsRNAs、siRNAs、shRNAs、esiRNAs。不同細胞類型適宜的導(dǎo)入系統(tǒng)也不同。常見的導(dǎo)入系統(tǒng)包括shRNAs病毒轉(zhuǎn)導(dǎo),shRNAs、siRNAs、esiRNAs或dsRNAs脂介質(zhì)轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)[16],或?qū)τ诠壖毎珊唵蔚匕鸭毎蚫sRNAs在溶液中混合。在RNAi HTSs中需要考慮一些重要因素,包括進行至少1次重復(fù)試驗,選擇適宜對照,數(shù)據(jù)質(zhì)量早期評估等[17]。

        3 高通量RNAi篩選的應(yīng)用

        盡管與其他經(jīng)典基因篩選相比, RNAi HTSs還處于發(fā)展初期,但已開展了大量研究,并對許多領(lǐng)域產(chǎn)生了重要影響,尤其是在細胞功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥生物學(xué)等方面。在果蠅和哺乳動物細胞中已對多種細胞生物過程進行了研究。

        3.1 細胞活力和擴增細胞擴增和存活與人類疾病,如癌癥有特別的關(guān)系?,F(xiàn)已建立起完善的以自動方式檢測細胞數(shù)量、活力和基本代謝的常規(guī)方法。早期細胞基礎(chǔ)RNAi HTSs研究中,進行了大量篩選用以鑒定與細胞擴增,存活相關(guān)的基因[18]。而近期研究已篩選出多種與哺乳動物細胞生存和擴增相關(guān)的基本因子,特別是癌癥細胞的基本因子[19]。這些研究都表明在多種細胞類型中有幾個基因與細胞存活或擴增相關(guān)。

        3.2 細胞分裂、細胞死亡和細胞周期采用混合式篩選或簡單可行的試驗可檢測細胞增殖或活力變化,利用特異報告子、細胞循環(huán)FACS分析或以圖像為基礎(chǔ)的檢測讀出器可揭示出與細胞分裂、細胞死亡或相關(guān)過程有關(guān)的特異表型。這些研究結(jié)果包括發(fā)現(xiàn)許多人類激酶、磷酸酶、蛋白質(zhì)是與蛋白水解相關(guān)的[20];許多蛋白與中心體增殖有關(guān)[21];早期esiRNA為基礎(chǔ)的篩選在人類HeLa細胞中鑒別了多種與有絲分裂和細胞質(zhì)分裂等方面相關(guān)的候選基因[22]。

        3.3 細胞死亡和生理節(jié)奏在哺乳動物細胞中的一項研究表明,許多基因需要RIP1激酶介導(dǎo)細胞壞死和細胞凋亡[23]。細胞死亡也是在果蠅細胞中進行篩選的特異熱點[24],與新陳代謝調(diào)節(jié)子如Charlatan和ARD1在半胱天冬酶激酶有關(guān)[24]。此外,人類晝夜節(jié)律鐘中激酶和磷酸激酶研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白激酶2能被PER2磷酸化。鈣在細胞功能上的作用也集中在果蠅細胞的多個RNAi HTSs研究中,在這些研究發(fā)現(xiàn)了鈣通道和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[25]。

        3.4 細胞壓力反應(yīng)許多篩選分析了細胞對壓力條件的反應(yīng),如一項關(guān)于果蠅基因RNAi HTSs研究中,檢測細胞對低氧環(huán)境的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)了Tor通路組分和蛋白酪氨酸磷酸酯酶61F,在低氧反應(yīng)翻譯的調(diào)節(jié)中起重要作用[26]。此外,全基因組綜合掃描哺乳動物基因,發(fā)現(xiàn)某些基因的下調(diào)能產(chǎn)生對壓力的耐受性[27]。

        4 展望

        應(yīng)用RNAi HTSs發(fā)現(xiàn)了許多新基因,并已成功地應(yīng)用于研究許多重要的生物學(xué)問題。RNAi HTSs的研究結(jié)果驗證了許多基因與特定的過程相關(guān)的這一觀點,如細胞活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、宿主病原體相互作用等,與篩選獲得的不同通路和復(fù)合體高度聯(lián)系又相互獨立。然而高效的RNAi篩選仍需要大規(guī)模的試驗驗證和高效的RNAi試劑的支持,對高通量的驗證方法以及在體內(nèi)證實RNAi結(jié)果是有意義的研究方向。隨著基因、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,RNAi HTSs將作為基因功能研究的有效工具,為生物和生物醫(yī)學(xué)作出更多貢獻。

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        RNAi High-throughput Screens and Its Application in Cell Biology Research

        XIN Ji-ge1,2, ZENG Yang-zhi2

        (1. Animal Science and Technology College, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201; 2. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred Line of Yunnan Province, Kunming, Yunnan 650201)

        RNAi high-throughput screens(HTSs) is an effective tool for analysis of gene function in genome-scale. Now a number of genome-scale RNAi HTSs have been done in cultured cells of many species to study diverse biological processes. The RNAi HTSs have made important contributions to the developments of biomedicine. The RNAi technology principle, experimental manipulation and its application in the related gene of cell biology research were reviewed.

        RNAi; High-throughput screens; Cytology

        國家自然科學(xué)基金項目(31360532);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2013FB041)。

        信吉閣(1981- ),女,吉林樺甸人,實驗師,博士,從事胚胎生物技術(shù)研究。*通訊作者,教授,從事遺傳學(xué)方面的研究。

        2014-12-02

        S 188

        A

        0517-6611(2015)02-012-02

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